首次培养的细胞，是指直接从活体组织取出后的原代细胞，它们最大程度保持了来源组织的生物学特性以及遗传信息。在基础生命科学研究这儿，原代细胞是模拟体内生理状态的理想模型，其应用涵盖了药物筛选、病毒学研究等好多不同方向。

原代细胞分离技巧

要获取高质量的原代细胞关键环节涵盖组织处理以及酶消化法的挑选，不同组织类型所适用的酶组合具有显著不同，比如说肝组织通常使用胶原酶，然而神经组织却需要更为温和的胰蛋白酶，操作期间要把组织剪成 1 至 3 立方毫米的小块，于 37 度的条件下进行 30 至 60 分钟的消化工作，在这期间每隔 10 分钟要轻轻摇晃一回。

细胞悬液经消化后，要通过100微米细胞筛进行过滤，以此去除未消化的组织碎片，接着用红细胞裂解液处理，这样能够有效排除血细胞干扰，整个分离过程需控制在2小时内完成，因为时间过长会显著降低细胞活率，新手建议从脾脏或肾脏等结缔组织较少的器官开始练习。

原代细胞培养难点

原代细胞对于环境方面的变化是极其敏感的，培养基的构成成分、pH的值、渗透压的微小起伏变动都有可能致使生长呈现停滞状态，血清的浓度一般情况下是需要比细胞系高出百分之五至百分之十的程度，并且不同批次的血清是需要预先进行测试的，培养箱的湿度是必须维持在95%以上的数值，以此来避免因液体蒸发而引发的渗透压升高。

还有一个常常出现的问题是，成纤维细胞过度地增殖致使目的细胞的生长受到抑制，解决的办法涵盖差速贴壁法，通过利用成纤维细胞贴壁更为快速的特性来实施分离，或者朝着培养基里添加适量的L - 亮氨酸甲酯，以此选择性地清除成纤维细胞，要定期去观察细胞形态的变化，一旦出现空泡或者颗粒增多的情况，就应当马上调整培养条件。

原代细胞传代注意事项

和原代细胞相较，传代次数被严格限制，一般仅仅能够稳定传三到五代。每一次传代之前都得确认细胞融合度处在百分之八十至百分之九十，传代过晚会加快老化。胰酶消化的时间需要精准把控，以细胞变圆然而并未脱落作为最佳状态，过量消化会对膜蛋白造成损伤。

传代的比例通常不会超出一比二，然而高密度进行培养反倒有益于维持细胞的功能。建议于传代之后第一天添加诸如维生素C之类的抗氧化剂，以此帮助细胞去抵抗氧化应激。每一次做传代都需要记录代数编号，当超过五代之后细胞形态呈现出梭形化的时候，应当坚决地丢弃并重新进行制备。

原代细胞冻存与复苏

进行原代细胞冻存操作时，要采用那种含有高浓度血清以及10%二甲基亚砜的冻存液，并且要运用程序降温盒，按照每分钟下降1度这样的速率，将其冷却到零下80度。要是直接把它投入液氮的话，会因为冰晶形成致使细胞膜破裂。每一支冻存管里面的细胞量必须达到1×10的6次方以上，才能够确保复苏之后的存活数量。

展开复苏操作之时务必要做到快速，把冻存管安置到处于37度温度的水浴锅当中开展震荡以此实现解冻，要于1分钟之内达成融化的状态，解冻完成之后要马上运用预热的培养基去稀释二甲基亚砜，以低速的方式进行离心以此去除残留，复苏过后的细胞需要最少经24小时才能恢复到贴壁的状态，在这期间不要过于频繁地去进行观察或者移动培养瓶，要是活率低于60%，建议重新进行制备而不要勉强去使用。