兔原代细胞怎么提取

分离兔组织中原代细胞，一般采用组织块贴壁法或者酶消化法。就拿兔肾皮质来讲，先把新鲜组织剪成1mm³小块，接着用0.1%Ⅰ型胶原酶于37℃进行40分钟的消化，在这期间每隔10分钟要轻轻摇晃一次。消化完毕后通过100目细胞筛过滤，再经离心收集，这样就能得到活性不错的肾小管上皮细胞。整个这个过程需要在超净工作台去完成，所有的器械要提前进行灭菌，以此来避免细菌以及真菌的污染。

适合兔肝细胞、肺成纤维细胞等松散组织的是酶消化法，而皮肤和软骨更适宜组织块法。要注意控制消化时间，时间过长会损伤细胞膜，时间过短则分离不彻底。首次进行操作时建议先做预实验，通过用台盼蓝染色来评估细胞活率，要确保活率达到85%以上之后再展开后续培养。提取后的细胞需要尽快接种到预先已包被多聚赖氨酸的培养瓶中。

兔原代细胞培养注意什么

选择培养基，会直接对细胞贴壁以及增殖效率产生影响，兔原代成纤维细胞呢，则以常用的DMEM高糖添加10%胎牛血清最为适用，另一只关于兔肾小管上皮细胞的情况，它所需要的是DMEM/F12混合培养基呀这其中还得补充胰岛素、转铁蛋白等因子才行，pH值要控制在7.2 - 7.4之间，培养箱得保持37℃体温、5% CO₂湿度饱和的状态，首次换液在接种后24小时进行，加入时要轻柔沿着壁面添加，以此避免冲起贴壁细胞。

兔原代细胞培养，污染防控是其成败的关键所在，每一批血清在使用之前，都要经过0.22μm滤膜进行过滤，并且在培养液之中加入1%双抗，若是观察到培养液呈现浑浊状态，或者pH突然变黄，又或者细胞出现空泡，这就提示很可能发生了支原体污染，建议每周运用PCR法检测一次，一旦发现阳性样本，要立刻丢弃，还要对培养箱进行彻底消毒，当细胞长至80%融合的时候，按照1:2进行传代，传代的次数不适合超过5代，再不这样的话，原代特性就会渐渐丧失。

兔原代细胞鉴定方法有哪些

形态学观察乃是最为基础的鉴定手段，在倒置显微镜之下，兔原代成纤维细胞呈现出长梭形，其胞体透亮，排列成放射状或者旋涡状，兔肾小管上皮细胞则呈现为多边形，呈铺路石样排列，细胞核清晰能够看见，照下各种不同时间点的形态变化，将其与文献里的典型图片相对比，能够初步判定细胞类型是不是符合预期，留心原代细胞经常会混杂着各种各样的细胞，需要进一步去做特异性染色。

针对兔源细胞挑选相应抗体，像是用角蛋白抗体去标记上皮细胞，波形蛋白抗体标记成纤维细胞，这个免疫细胞化学染色能给出更可靠的证据，操作时先对细胞进行固定，用过氧化氢封闭内源酶，一抗在4℃孵育过夜，二抗在室温孵育30分钟，DAB显色后用苏木精进行复染。阳性细胞胞浆呈棕黄色，计数200个细胞来计算阳性率，超过95%才可以认定为目的细胞。并且流式细胞术也能够用于批量检测表面标志物。