利用特异性荧光探针于扩增进程中凭借实时释放信号以精准检测目标序列的探针法荧光定量PCR归属为一种具备高灵敏度的核酸定量技术，相较于染料法而言，其能够有效地避开非特异性干扰，适用于多重基因检测以及低丰度样本分析。

探针法荧光定量PCR原理是什么

该技术是以Taq曼探针的水解遵循的原理为依据的，探针的两端各自都标记着荧光报告基团以及淬灭基团。待处在探针完整的状况之下，荧光是会被淬灭的。在PCR退火的阶段，探针会和模板实现结合。当延伸的时候，Taq酶所具备的外切活性会把探针切断，报告基团会远离淬灭基团，进而会发出可以被检测到的荧光信号。荧光的强度跟起始模板量呈现出正比关系。

引物和探针如何设计

在进行引物设计之际，要将扩增片段的长度把控在70至150bp的范围之内，引物的Tm值需处于55至60℃之间，GC含量要维持在40%至60%的水平。探针的Tm值应当比引物高出5至10℃，其长度为20至30bp，并且5'端不可以是G碱基，以此来防止淬灭报告基团。要运用专业软件去检查二级结构，避免探针与引物形成二聚体，从而确保扩增的特异性。

实验优化有哪些关键点

镁离子的浓度需优化到3至5mM，要是镁离子浓度过低，那扩增效率就会降低，倘若过高，非特异性产物便会增加。探针浓度一般是50至200nM，引物浓度为200至400nM。退火温度比探针Tm值低5℃，利用梯度PCR来确定最佳温度。添加热启动Taq酶以及UNG防污染系统，能显著提高数据稳定性。

常见问题及解决办法

若荧光信号呈现出微弱的状况，那就去检查一下探针是不是存在降解的情况或者淬灭基团有没有失效，然后更换新鲜标记好的探针。倘若扩增曲线呈现出“S”型的异常状态，一般是因为引物二聚体所导致的，那就尝试去提高退火温度或者重新去进行引物的设计。基线出现漂移大多是由模板降解而引发的，建议使用没有RNase的耗材并且将样本分装保存。