把起始模板量进行精准测定的实时荧光定量PCR，也就是qPCR，是通过对荧光信号进行实时监测来达成的，它不需要进行电泳，其动态范围比较宽，在基因表达做分析、转基因检测以及微生物展开定量这些方面被广泛运用。若想要得到可靠的数据，在引物设计、Ct值解读以及染料选择诸多环节是需要下一番功夫的。

引物设计注意什么

规定引物的长度要控制在18bp至25bp之间，而其中GC的含量需要把控在40%至60%，并且3’端要避免出现连续的G或者C。扩增产生的产物长度处于80bp至150bp是最为适宜的，倘若过长的话则会使扩增的效率有所降低。要用Primer - BLAST或者Oligo软估测二级结构，以此保证不会形成发夹以及引物二聚体。

设计完成了之后，一定要去验证其所具有的特异性，在并非模板对照的反应之中，不应该出现Ct值，或者出现的时间非常晚，熔解曲线应当是单一的尖峰，不存在杂峰，针对SYBR Green法而言，建议设计跨越外显子边界的引物，防止基因组DNA污染对定量结果构成干扰。

Ct值过高怎么办

Ct值要是超过35，一般就意味着模板量比较低，或者扩增效率不太好。首先得去检查核酸提取的质量，A260/A280应该处于1.8至2.0的范围之间。在反转录的步骤当中，运用随机引物和oligo(dT)混合物能够提升覆盖度。适度增加模板的上样量，或者进行预扩增，这也是常用的办法。

要排除模板问题的话，就得去评估引物效率，用标准曲线法计算，斜率处于-3.1到-3.6之间，这对应的扩增效率是90%至110%，要是效率偏低，那就优化退火温度，或者重新设计引物，在反应体系里添加BSA，能减轻抑制物对扩增的干扰。

SYBR Green还是TaqMan

SYBR Green法成本低廉，不需要进行合成探针的操作，适宜开展大规模基因表达差异的筛选，然而非特异扩增会致使出现假阳性情况，每次实验都一定要运行熔解曲线并且要设置无反转录对照，对于靶基因数量众多、预算有限的情形，这是首选的方案。

TaqMan探针法具备极高的特异性，适宜用于多重定量以及稀有序列的检测，然而其探针设计合成的成本比较高，周期也比较长，当存在需要绝对定量或者检测高度同源序列的情况时，推荐运用TaqMan法，要是实验规模较小并且追求数据的稳健性，多花费成本往往是更具价值的。