为什么我的实验数据总是不稳定

上个月在杭州滨江的一个生物技术公司，我见到老朋友王磊。

穿着白大褂的他，从实验室走了出来，他的眼睛里带着血丝，显然一看就是经过了熬夜去做实验这一状况。

王磊身处一家第三方的检测机构里头，充当着技术主管的职位，司职专门针对环境样本所开展的酶活性检测工作。

谈及最近的状况，他发出长长的叹息讲道，“近来遭受生化试剂盒极大的困扰，针对同一个样本进行了三次测量，然而得出的结果差异程度极为夸张。”。

我向他询问究竟是怎么一回事，他拽着我来到了旁边的那家咖啡馆，将这长达三个月的经历一口气毫无保留地倾诉了出来。

今年二月上旬，王磊所在的公司承接了一批土壤样本，需要对其之内的过氧化氢酶活性展开测定。

往日里，他们采用传统滴定法，然而样本数量众多，耗费时间漫长，手部只要略微颤抖一下，误差便会超出百分之十。

主管催着他提高效率，王磊就想到改用市面上的生化试剂盒。

他于某电商平台进行搜索，搜索的内容为“过氧化氢酶试剂盒”，之后他看中了一个品牌，该品牌销量处于靠前位置，并且其价格并不昂贵，一盒五十个样的情况下共需八百块。

三天后试剂盒到货，他按说明书加样、孵育、用酶标仪读数。

头一回做出来的标准曲线，其相关系数仅仅是零点九一，远远不及零点九九的合格标准线，差得远呢。

王磊觉得是自身操作欠缺熟练度，再次进行了重复，然而系数却降至零点八八。

用生化试剂盒踩过哪些坑

那两天他反复看说明书，琢磨是不是样本前处理出了问题。

他的实验室处于萧山，三月天气仍存有凉意，他每日清晨七点便抵达，直至晚上十点才离开。

第三次进行实验时，他将使用的缓冲液换成了新鲜配制而成的缓冲液，并且把样本离心的转速，从之前的三千转提升到了一万两千转。

结果依然不理想，空白对照的吸光度竟然比样本还高。

试剂盒本身存在问题，这使得王磊开始产生怀疑，他因而联系了厂家技术，然而，对方却让他去重新做标准品梯度。

“王磊回忆当时的心情，既烦躁又不服气，表示标准品浓度自己算错了在他看来是不可能的事，毕竟之前他算过两遍。”。

他从事了尝试，运用另外一家进口品牌所出品的试剂盒开展对比工作，针对同一个样本，该进口盒子的标准曲线系数达到了零点九九五。

此时，他清楚了，并非是自身操作存在问题，而是那一款价格低廉的试剂检测盒的组成成分不稳定。

让他愈发生气的是，他把数据传送给了厂家，可对方最终认可是标准品于运输进程里有可能失去活性了。

王磊经此一事受到了教训，他讲出这样的话来：“在这之前呀，一直觉得生化试剂盒不过就是那种工具盒罢了，反正哪一家生产的都能够同样去使用呢。”。

现在，他归纳出了三个方面的教训，其一，并非仅仅着眼于销量以及价格，而是必须去核查厂家是否提供了质控报告。

在收到试剂盒之后，要先去做预实验，然后通过用已知活性的标准品，要来验证线性范围，千万不要直接就将真实样本给应用上去。

保存条件得严格把控，有一些组分非得在负二十度且避光的环境下才行，普通冰箱的冷冻室因为温度波动幅度较大，所以会致使其失效。

怎么选生化试剂盒才对

4 月中旬的时候，王磊又将开展一批污水处理厂活性污泥样本的检测工作，此次所检测的项目是脱氢酶活性。

他耗费了整整三天时间来筛选试剂盒，首先罗列出五个主流厂家，接着前往各个厂家的官网去下载说明书。

着重留意几个指标：检测的限定界限，定量的限定界限，线性所涵盖范围，批次内部以及批次之间的变异系数。

他又拨通电话给两个厂家的技术支撑人员，询问他们那里的标准品行用的是什么来定值，是否存在第三方检测报告。

最终，他挑选了一款国产试剂盒，其价格处于适中水平，相较于最便宜的那款，贵了百分之四十，而且它的参数清晰写明批间变异系数小于百分之五。

试剂盒到货。之后，他首先进行标準曲线的制作。其相关系数为零点九八，仍处于可接受范围之内。

不过呢，他并没有赶忙去测样本，反而是又进行了加标回收实验。他取了一份混合样本，把这份混合样本分成了三份，其中一份是不添加标准品的，另外两份则分别添加了低浓度以及高浓度的标准品。

低浓度的回收率为百分之九十一，高浓度的回收率是百分之九十七，这两者都处于在百分之八十五至百分之一百一十五的合格范围之内。

他这才怀揣着放心的状态，将全部六十个样本拿去上机进行检测。检测结果在一天之内就全部得出了，其中重复样本的相对标准偏差仅仅为百分之三点二。

生化试剂盒操作要注意啥

王磊说，方法学验证只是第一步，操作细节才是决定成败的关键。

他列举了一个事例，那就是用于加样的枪头，存在这样的情况，有的人出于节省费用的目的而进行重复使用，先经过清洗之后再予以烘干处理，然而实际上其内壁所残留的样本会对下一管造成污染。

在他的实验室之中，有着这样一项规定，那就是所有与试剂盒相关的操作，都必须要使用带有滤芯的无菌枪头，而且这个操作要求是一枪一换。

存在着孵育温度以及时间的把控，部分生化试剂盒规定为三十七度进行水浴，然而水浴锅的温度均匀程度常常欠佳。

王磊采取的办法是，将其更换为金属浴模块，在开机之后，提前半个小时使其开启，进而让温度能够保持稳定状态，随后，运用经过校准的温度计，对孔内温度进行实地测量。

显色反应绝不能够掉以轻心。他讲上个月存在一位实习生，同时进行了两块板的操作。添加显色剂的时间段竟相差三分钟，最终两块板呈现出的读数相差了百分之十五。

此时，他们实验室有着这样的规定，从增添显色剂开始，到将其放置于酶标仪那儿去进行读数，这二者之间的间隔，必须要严格把控在说明书所要求的一分钟之内，一旦超出这个时间，那就得重新去做。

王磊自行设计了一个操作核对表，将其张贴在实验台旁边，该核对表涵盖了试剂解冻时间，包含离心转速，还有孵育温度等二十多个检查项。

数据异常时怎么做排查

即便按标准流程做，偶尔也会遇到离谱的结果。

五月刚刚开始的某一个夜晚，王磊于检测一批土壤脲酶活性进程之际，发觉所有样本的吸光度均与空白极为临近。

他第一反应不是怀疑样本本身没活性，而是先做系统排查。

他把先前经过验证且合格的质控样本拿出来，再次进行测量，最终结果呈现正常状态，这表明试剂盒并未出现损坏情况。

接着，他对样本保存记录展开检查，随即发觉，这批土壤在取样之后，被放置于四度的冰箱之内，历经了整整两周的时间，方才进行处理。

通过查阅文献方才知晓，脲酶于低温潮湿的环境之中会渐渐地失去活性，两周的时间很有可能已降解了超过百分之六十。

他立刻联系采样同事，确认样本是取回来就忘了。

王磊讲道，碰到异常情况时，不要急着去怪罪试剂盒，而是需要依照相应顺序进行排查，具体顺序为，试剂盒的质量控制情况，样本的前期处理状况，样本的保存条件怎样，操作步骤是否正确。

他另外养成了一种习惯，每回的实验，都留出最少三个重复的质控样本，夹在等待检测的样本中间。

假使质控样本结果出现漂移，那么整批数据就得作废。要是质控处于正常状态，然而仅有个别样本呈现异常，那么问题便存在于样本自身了。

生化试剂盒的未来趋势

聊到最后，王磊说起今年四月参加上海一个分析仪器展的见闻。

有好几家国内的厂商，推出了全流程预分装的双抗夹心法试剂盒，他看到了，并且其中连标准品都预冻干在孔里。

用户仅需添加样本以及缓冲液，在孵育之后直接进行读板，手工这种操作所花费的时间由两小时被缩短至二十分钟。

存在一些生产厂家，正在致力于开发手机应用程序，借助普通的手机摄像头，足以读取试纸条或者微孔板呈现出的颜色，并不需要使用价格高昂的酶标仪。

王磊认为，这些新技术为基层实验室带来福音，与此同时，他还进行提醒，自动化并不意味着能够省去方法学验证。

当前，他所秉持的原则是，无论哪一款试剂盒，在拿取回来之后，都要先采用自身的样本基质去开展一次全面且完整的验证操作，随后将所获取的数据进行存储，以此当作基准。

并非所有价格贵的都是好的，那些价格便宜的基本上靠不住，处于中等价位的，只要花些心思去验证，完全能够满足日常检测的需求。

这是王磊用三次失败的实验和一个多月失眠换来的经验。

要是你同样是借助生化试剂盒去开展酶活性或者代谢物检测工作，那么不妨先耗费两天时间来验证线性范围以及加标回收率。

保证能顺顺利利出数据的后续几百个样本，是建立在经过验证通过的试剂盒，且遵循磨刀不误砍柴工这一原则基础之上的。