做生命科学研究的朋友，大概都绕不开基因表达定量这件事。

你是否也曾碰到这般状况，同一个样本，多次重复去进行实时荧光定量PCR，然而结果却无法对应，Ct值一会儿高一会儿低，使人全然摸不到头绪。

我存在一位名为老张的朋友，于一间生物检测公司从事研发工作，前段时间正是由于这件事情历经了长达大半个月的折腾。

他跟我谈及那段经历之际，不停地直摇头，声称那几日就连做梦的时候，都一直在思索反应体系究竟是哪儿出现了问题。

我觉着呀，他所拥有的经验，极其值得把它拿出来讲一讲，没准儿能够帮到你，使得你少走好多的弯路呢。

老张现今是三十二岁的年纪，在苏州工业园区那儿，于一家从事生物技术的公司，待了超过四年的时长。

他们所在的团队，主要从事的是环境样本里微生物基因表达的分析工作，每天都要与实时荧光定量PCR进行接触。

今年四月上旬，公司收到了一批涉及土壤样本的检测差事，需要对其中特定的某种功能基因的表达程度进行定量剖析。

搭建整个实验体系的任务由老张负责，他依据之前用过的引物与程序，满怀信心地开启了上机操作的进程，他上机了，他上机时信满满得很呦。

结果一经出炉，他瞬间傻眼啦，这三个经过重复操作的孔之间，其Ct值的差异竟然超过了1.5个循环呢。

依据行业当中被大家所共同认可的标准，反复出现的孔的标准差要是超过了零点三，那么就极难确保数据是可靠的了。

实时荧光定量pcr重复性差怎么办

老张第一反应是加样出了问题。

当天他进行操作，仔细回首思索，实情乃是时间紧迫，八连管排列妥当之后，加样之际，他的思绪竟两次游离走神。

然而，他却又觉着，不至于会有如此大的差别，这是为啥，只因使用的乃是那种带有滤芯的枪头，并且，他也都认认真真地进行吹打操作了。

他依旧再次做了一回，此次每一步都把动作放缓一些，添加完一个样本后就轻轻地扣上盖子。

可是，到了第二天跑出来的那个结果呀，其重复性相较于上一次情况而言，还要更差一些呢，存在着有的孔直接就没有出现扩增曲线这种状况。

这下老张彻彻底底地没有办法保持淡定了，他把他自己关进了实验室里，对着仪器发了两个小时的呆。

排查模板和引物的质量

他决定从头开始排查。第一步先检查引物和探针。

这一组引物，是在半年之前合成的，一直被放置于负二十度的冰箱内，按照常理来推断，应当是不会发生降解现象的。

然而，他依然再次进行了稀释操作，制作出了一管全新的工作液，与此同时，还顺便开展了一次琼脂糖凝胶电泳操作。

这个现象表明，电泳图所呈现出来的情况是，引物二聚体的条带相对比较亮，这意味着引物自身实际上是存在着一定程度的非特异性配对的。

老张急忙去查当时的设计记录，查到正向引物的3'端存在两个连续的G，而这种结构极易形成发夹。

他马上就此做出决定，要再次去设计一对引物，将那3'端位置上的GC所含比例把控在40%直至60%这个范围之内。

实时荧光定量pcr的反应体系配制技巧

新引物到货需要三天时间，老张也没闲着，他开始优化反应体系。

他平日里惯于把预混液，以及引物，还有探针，甚至水与模板，全都核算好体积，一次性配制成一个大反应 mix。

然而，他却遗漏了不同样本相互之间的模板浓度存在的差异情况。土壤样本所提取出来的DNA之中常常会带有诸如腐殖酸之类的抑制剂。

这些抑制剂，会在每个反应孔里进行不均匀的分布，进而使得同一块板上，不同孔的扩增效率不一致。

老张采用了一个显得愚蠢的方法，这个方法是，针对每一个样本，单独去配制预混合的液体，在完成分装之后，再分别加入与之相对应的模板。

他又将每个反应体系的总体积，从二十微升增大到二十五微升，以此降低随机误差所产生的影响。

三天后新引物到了，老张先做了一轮标准曲线预实验。

他用已知浓度的质粒标准品进行十倍梯度稀释，一共做六个点。

扩增结束以后，相关系数于标准曲线上已经达到了0.998，扩增效率为98%，此数值很接近理论值为100%。

熔解曲线也只有一个尖锐的峰，说明引物特异性很好。

老张心里踏实了不少，但彻底解决问题还差一步。

实时荧光定量pcr的仪器校准和耗材选择

他留意到，实验室里的那台，实时荧光定量PCR仪，已然持续运转了，差不多一年的时间。

上次做光路校准和温度验证，还是去年六月份的事。

他跟仪器管理员申请做了一次全面的性能验证。

结果显示，第六通道的荧光采集值比标定值低了将近百分之十二。

温度模块于第九十六孔处的偏差，达到了正零点五度以及负零点五度，然而呢，平常所要求的情况是，不得超过零点三度这样一个数值呀。

老张赶紧联系厂家工程师做了校准和温控模块的维修。

他与此同时更换了一批实验耗材，此前所使用的八连管乃是国产范畴内的一个杂牌产品，其管壁的厚度呈现出不太均匀的状况。

他做了更换，换的是某个知名的、进口的品牌的白色的管，听说据说能凭借这个使得荧光信号的采集效率提升不少。

白色管壁可以反射更多的激发光，减少孔与孔之间的交叉干扰。

他还进行了确认，每一根管子的盖子都需要盖得严实紧密一点不过于紧密，不然会对光学检测造成影响，进而产生不良后果。

实时荧光定量pcr的数据分析注意事项

等待仪器校准完毕，新的耗材到达，之后，老张再次去走了一回那一批土壤样本所经历的流程。

此次，他另外设置了无模板的对照，还设置了无反转录的对照，以此来对污染以及基因组残留进行监控。

扩增曲线出来的时候，他守在电脑屏幕前一个一个孔地看。

三个彼此重复的孔范围之内的Ct值，其标准偏差全都被控制在零点二这个数值以内，扩增曲线所呈现的指数期斜率，基本上处于平行的状态。

熔解曲线还是没有杂峰，阴性对照直到四十个循环都没有起峰。

老张长出了一口气，这一轮的苦总算没有白吃。

但真正让他学到东西的，是后续的数据分析过程。

他以往做实时荧光定量PCR，惯于径直采用仪器自身所带的软件自行计算Ct值以及基线。

这次他手动检查了每一个反应孔的基线设置。

有几个孔的基线起点，被他发现设在了循环数三以及十五那里，并且扩增曲线在第十循环的左右时段，就开始出现抬升的情况。

这致使自动计算得出的Ct值相较于实际情况偏大，老张再度手动对基线起点进行设定，将其下调至循环数六到十八。

将那之后的几个样本的Ct值进行调整，平均降低了零点六个循环，三个重复孔的数据，变得更加一致了。

实时荧光定量pcr的阈值线和参考基因选择

他思索了内参基因的挑选相关情况，团队始终将16S rRNA用作土壤样本的内参基因。

不同土壤样本里，微生物群落的构成存在很大差异，不同菌种之间，16S rRNA的拷贝数悬殊。

老张查阅了文献，这文献是最近两年的，查阅后发现，有人建议针对特定环境的样本，使用多个内参基因，去取几何平均值。

他再次从这一批样本当中，挑选出了三个候选的内参基因，分别是，16S rRNA，还有RpoB，以及RecA。

先借助实时荧光定量PCR，分别去测定它们的Ct值，之后呢，再运用专业软件，来分析表达稳定性。

进而发觉，有着最佳稳定性表现的是RpoB ，但在这个样本组当中 ，系数之变异呈现明显偏高态势的却是16S rRNA。

换成RpoB当作内参之后的老张，最终数据里的组内变异减小了差不多百分之四十。

那天下午老张请我喝咖啡，说起这件事时语气特别感慨。

他讲，进行实时荧光定量PCR，看起来仿佛仅仅是配制一个反应。然后，把它放置到机器上。最后，得出一个数据这般轻易。

但任何一个环节出点小问题，最后出来的数据都可能完全没法用。

引物进行设计，试剂开展分装，仪器查看状态，耗材考量品质，基线实施设定，内参予以选择，每一个步骤都必须认真对待，不能马虎。

他专门特意对我进行提醒，要是实验重复性始终老是没办法搞定，那么能够先从加样的方式以及引物的质量方面开始查找。

这两个环节出问题的概率最高，解决之后大部分情况都能改善。

他在那之后，将那段时期所踩到的坑，整理成了一份内部操作手册，而后把它发送到了公司共享盘里。

在上个月的时候，他们那个团队又接纳了一批底泥样本，他依照优化过后的流程，从起初开始完整地奔跑运作了一回。

结果特别漂亮，三个生物学重复之间的标准差最大才零点二一。

连隔壁做代谢组学的同事都跑来问他用的什么秘诀。

老张讲，哪里会存在什么所谓的特殊诀窍呀，仅仅是把每一个步骤，都看作是最为关键重要的一个步骤，然后如此去做而已。

要是你同样在开展与之相仿的实时荧光定量PCR试验，那不妨依据此来核查一下自身的操作处理。

瞅一瞅引物的熔解曲线是否为单峰，瞧一瞧重复孔之间的 Ct 值差异是否显著。

重新查看一下，你所用的仪器于近期是否进行过校准操作，其使用的耗材是否适配该机器的光学系统呢。

这些问题，看上去琐碎，然而常常是它们，暗暗地偷走了你的数据重复性。

期望你们在读完老张所历经的事情之后，能够减少几次去撞那南墙的情况，并且能够更早地获取到稳定且依靠得住的结果。