近些日子，有个朋友老张，他在生物医药研发这个领域深入钻研了好些年，他跟我讲起了他最近那一段工作经历，这经历很是波折，却又收获颇丰。老张在一家研发机构当项目负责人，那家机构专门热衷于心血管疾病创新疗法的研究。他们那个团队始终都努力着，通过利用兔原代细胞，去构建更契合人体生理状态的疾病模型，以此来加快新药筛选的流程。假设你同样投身于相关研究工作，或者正因为原代细胞培养时候存在的稳定性问题而感到苦恼烦闷，那么老张经历的这段遭遇困难又解决困难的历程，也许能够给你带来一些切实有用的启示。
为什么兔原代细胞在心血管研究中备受青睐？
选择兔作为模型动物，成了老张团队的决定，这可不是偶然的。兔的心脏，在大小方面，在结构方面，以及在电生理特性方面，跟人类有着较高的相似性。而这就致使，从兔心脏分离出的原代心肌细胞，变成了研究心肌缺血、心律失常等疾病的理想工具。和永生化细胞系比起来，兔原代细胞保留了体内更完整的信号通路，还保留了功能特性，所以实验数据就更具说服力。老张最初就是看中了这一点，才满怀信心地启动了项目。
但是，理想是充满丰富想象的，而现实却给他来了个沉重打击。去年秋季的时候，他们的项目步入到关键的数据再次审核阶段，然而却接连有好几次在进行重复试验的时候遭遇挫折。
兔原代细胞培养失败的主要原因有哪些？
细胞活性中首先出现了问题，依据他们多年以来延续使用的经典分离流程来进行操作，在十月初那次的关键批次制备期间，当细胞收获之后，其存活率突然急剧下降到了50%以下，这远远不能够达到实验所要求的85%。在显微镜下进行观察，细胞呈现出消沉萎靡的状态，并且贴壁的能力极其糟糕，几乎根本没有办法形成能够用于后续电生理检测的致密单层。
老张回忆说，那段时间，实验室的气氛特别压抑 ，整个项目进度停滞不前了 ，我们再三检查操作步骤 ，从麻醉剂的用量 ，心脏灌流的速率 ，消化酶的品牌以及浓度 ，到离心重悬的力量 ，每一个环节好似嫌疑犯一样。他们甚至怀疑是实验动物的批次存在问题 ，然而更换了供应商以后 ，情况依旧没有得到根本性的改善。
如何优化兔原代心肌细胞的分离与纯化流程？
排除了操作方面以及动物来源出现的显性因素后，老张紧接着把目光投向了更底层的、更为精细的环节，他组织团队开展了一回彻头彻尾的“流程复盘”，又引入了更加精细的监控指标，他们随后发现，问题的核心极有可能隐匿在“时间”以及“环境”这两个极易被忽略的 dimension里。
此处所指的乃是组织离体之后的处理“时间窗”，往昔之时，他们对于消化时间予以了更多的关注，然而针对从动物实施安乐死起始，直至把心脏取出，进而进入灌流系统的这段“冷缺血时间”进行把控的时候却显粗放，借由严谨务必将这段时间控制在3分钟内侧，并且运用预冷的、成分清晰明确的缓冲液来开展快速转运，细胞初始损伤幅度显著下降。
在消化进程里的“微环境”。先前他们所用的消化液配方较为固定下来，然而却忽视了不同批次酶活性存在的细微差别以及消化进程中温度发生波动所产生的影响。老张团队引进了带有实时pH以及温度监测功能的灌流系统，并且把“分步消化、及时收集”的原则落实得更加彻底，也就是说消化那么一段时间之后，就去收集含有已经游离出来的细胞的液体，马上加入含有血清的培养基来终止消化，并非等到全部组织块都消化完毕之后再统一进行处理。这样的一个改变，切实有力地保护了先期游离出来的、品质处于最佳状态的那一批细胞。
怎样维持兔原代细胞体外培养的高活性和功能？
分离环节的问题得以解决，这仅仅如同万里长征迈出的头一步，怎样促使这些娇弱的细胞于培养皿之中，要能够使得它们“活得很不错”同时“干得蛮出色”（维持其收缩、电信号传导等特定功能），这构成了更为艰巨的挑战，老张团队针对培养体系开展了数量众多的优化尝试。
他们察觉到，仅仅运用高血清含量的经典培养基时，细胞虽说能够存活，然而易于过快地“去分化”，进而丧失成熟心肌细胞的典型特性，在经过文献调研以及条件筛选后，他们最终采用了一种专用培养基，这种培养基具备低血清的特点，还添加了特定的细胞因子，譬如 IGF - 1，以及代谢底物，像是肉碱，这种培养基仿佛是为细胞量身定制的“工作餐”，它既能够维系细胞的基本代谢，又能够激励细胞保持“工作状态”，也就是特异性功能。
培养基底的挑选同样是相当关键的，传统的明胶包被成效并不稳定，他们对多种细胞外基质蛋白（像是层粘连蛋白、纤连蛋白）的各异包被浓度以及条件做了测试，最终明确了最适宜兔原代心肌细胞伸展以及形成功能性网络的包被方案。今年三月，在上海浦东的研发中心，当老张于共聚焦显微镜下瞧见培养第五天的细胞依旧规律、同步地搏动，并且记录到强劲、稳定的动作电位时，他悬了半年多的心终于落了地。
兔原代细胞实验数据不稳定的解决方案
往回看时，老张所秉持这样的看法，兔原代细胞进行实验的成功或者失败，重要之处在于“标准化”情形还有“精细化”状况。众多数据出现波动，究其根源是一些可变参数没有受到有效的把控。他把他自身的经验归结为三个要点：
建立标准操作程序（SOP）并严格予以遵守，特别要对那些易被经验取代的步骤实行量化，像组织精确的修剪尺寸，消化液的流速，离心力以及时间等。
着重关注原料以及试剂的质量把控，不单单是像胶原酶、胰蛋白酶这类关键酶，涵盖基础培养基、血清、包被材料，甚至连配制用水也要构建起严格的验收以及批次记录制度；不同批次所存在的差异，或许就要通过微调后续参数去予以弥补。
强化过程的监控工作，切不可单单依靠终点时的细胞计数以及染色的结果，于分离、培养的关键时间节点上，借助台盼蓝染色、乳酸脱氢酶（LDH）释放检测等方式来开展中间品控，如此能够及时察觉问题，进而对后续步骤作出调整。
历经这一连串系统性的优化，老张团队不但化解了当下的项目危机，而且把兔原代心肌细胞的培养成功率稳固在了90%以上，实验数据的重复性以及可靠性显著提高，为新药候选分子的体外评价给予了坚实的数据支持。这段从屡屡失败迈向稳定成功的进程，使他深切领悟到，在生命科学研究里，特别是涉及原代细胞这类敏感材料之际，对细节的把控常常决定了结果的趋向。于每一个稳定且可信的实验数据的背后呀，都必然是少不得对于流程上面每一环的进行深思熟虑以及持续不断地打磨的呢。
