老张的实验困局，是不是也戳中了你？

在上周五的晚上十一点的那个时候, 我收到了老张打来的电话。在电话的另外一头, 他发出的声音是沙哑的状态, 同时带着一股怎么都压制不住的烦躁情绪, 就这样表达着: “又一次被废掉了, 这一批次的样品整个情况下全都白做了。”。

我于生物公司做技术支撑之际结识的朋友是老张, 如今他于一家头部药企的早研部门担任细胞生物学研究员。三月份时, 他们组承接了一个重要的靶点验证项目, 老张所负责的是其中最为关键的那一环, 也就是运用生化检测试剂盒, 对细胞裂解液里某一关键代谢物的浓度予以定量检测。

项目时间紧迫，老张起初偷懒想较为省事, 径直选用了在实验室常预备的通用试剂盒, 然而第一步标准曲线却未能成功跑通, R平方值仅仅为0.89 , 他依据经验重新对样品进行稀释、更换缓冲液, 一番折腾了整个通宵, 但最终结果依旧与质谱的参考数据无法对上。

“我都怀疑是不是自己手抖把细胞给污染了。”老张苦笑。

生化检测试剂盒到底怎么选才对？

其后, 我前往他的实验室, 进行实地查看。老张所使用的, 是一款老款的比色法试剂盒, 那说明书之上记载的, 检测范围是从零点儿一到十微摩尔每升, 然而, 他样品的实际浓度, 恰恰卡在零点儿零八强, 近旁。

我说, 你这呈现出的是那种典型的选择焦虑。就好比, 你去购置鞋子时的情况, 平常所穿鞋子尺码是42码。然而, 当你处于要去跑马拉松这个状况的时候, 却硬性买了一双41码的鞋子, 之后还责怪鞋子不合自己的脚。

生化检测试剂盒所具有的核心逻辑总共就两条, 其一为检测原理得跟你的样品基质相匹配, 其二是线性范围要将你的预期浓度区间给覆盖住。就如同老张这般从事细胞裂解液制作的情况而言, 其中所含成分繁杂, 蛋白质、盐离子及去垢剂都极有可能对显色反应产生干扰。他所用的那款老款试剂盒运用的是不具备特异性的显色原理, 一旦遇到高蛋白样品, 背景值会直接飙升至极高的程度。

换一个专业试剂盒，结果立马不一样

我建议他去尝试一下我们公司新近推出的、针对细胞裂解液进行优化的生化检测试剂盒, 这款试剂盒的配方特意添加了抗干扰稳定剂, 其线性范围拓展到了0.01至50微摩尔每升, 并且与之配套的校准品是经过质谱定值的。

老张处于将信将疑的状态之中, 然而依旧取了一盒回去进行试验。他依据说明书的要求, 以试剂盒所附带出现的稀释液来完成对样品的处理, 在设备上机的前期阶段又额外增加了一个样品空白对照的操作施行。在这一轮, 标准曲线R平方值径直达到了0.998, 三个平行孔的变异系数仅仅为2.1%。

老张在微信上发了一个笑哭的表情, 说道: “哎呀妈, 居然不是我手有毛病, 而是工具不合适。”。

第二次踩坑：操作细节才是隐藏的大坑

但是呢, 故事并没有就此结束。三天过后, 老张再次拨打了电话, 这一回, 他的语气显得更加急切了, 老张说道: “更换了属于你的试剂盒之后, 出现了几个呈现异常状态的值, 有两组数据的重复性表现得非常差。”。

是我让他把那实验记录通过拍照的方式发送过来的。当我一看的时候, 就发现存在问题了——在他进行加样操作的时候, 将试剂盒里面的反应液A以及反应液B的顺序给弄反了。并且呢, 他因为想要赶时间, 在加完试剂之后并没有充分地进行混匀操作, 而是直接就去上机读数了。

“老张，你这是在用炒菜的方式做实验啊。”我哭笑不得。

生化检测试剂盒的操作流程当中, 加样顺序乃是经过反复验证的了。况且孵育时间同样是经过反复验证而定的。哪怕仅仅只差一分钟, 又或者混匀的时候并不彻底。如此这般, 肯定就会致使局部反应不均匀。既然局部反应不均匀。那么所出来的吸光度值必然飘忽不定。更何况他所出现的那个异常值。那是由于加样枪头没有更换。进而带入了上一管的残留成分所致的。

试剂盒不是万能，但用对方法就是神器

老张再度制作了一批, 此次我特地前往他的实验室进行监督, 始于样品的前期处理, 各步骤皆依照说明书来执行, 于冰面上开展操作，加样之后以低速振荡30秒钟, 在37摄氏度下孵育刚好15分钟, 随后即刻放置到酶标仪上。

结果呈现出来之后, 老张就盯着那数据瞧了好长一阵子, 忽然间拍下了桌子一把, 说道: “线性度实在是非同一般得好, 跟质谱进行比对所产生的偏差达不到百分之五。”。

他此时每回开展实验之前, 都会率先将生化检测试剂盒的说明书由头至尾阅览一番, 借助荧光笔标记出要紧步骤, 张贴于实验台跟前。上个月他们小组的项目阶段性汇报, 他的那一部分的数据质量在全场是最为上乘的, 总监特地询问他运用了何种办法。

老张说：“哪有什么方法，就是把试剂盒当回事。”

写在最后

实事求是讲, 市面上的生化检测试剂盒种类繁多, 价格范围在几百至几千之间, 然而真正适配自身的仅有寥寥几款。挑选试剂盒恰似寻觅伴侣, 不能够仅仅着眼于宣传页所呈现的参数, 而要考量其与你所拥有样品之间的兼容性, 考量其在面对干扰时的抵抗能力, 考量其在操作过程中的容错概率。

要是你如同老张那般, 遭受过数据重复性欠佳、标准曲线无法顺利跑出、异常值不断反复出现这类问题的折腾, 不妨回过头去查验一下手中的试剂盒。有时并非是你能力不足, 而是你没有选对工具。

今年四月份, 老张所在的实验室进行内部对比测试, 针对同一批样品, 运用三个不同品牌的生化检测试剂盒开展平行试验。最终的测试结果显示, 仅老张所使用的那款试剂盒, 在检测限、精密度以及回收率这三个维度上均实现完全达标。而其他两款试剂盒的表现各不相同, 其中一款在低浓度段直接无法得出检测结果, 另一款的回收率仅为72%。

只有工具正确无误, 实验才能够顺利开展。唯有数据真实可靠, 结论才能够站得住脚。就是这么个道理, 老张耗费了三个月的时间才最终彻彻底底透彻明晰地搞清楚弄明白。但愿你不需要走上那么多种多样数量众多的弯路。