上周三, 晚上十一点的时候, 老张给我发来了一条微信语音, 那声音之中带着难以掩饰的兴奋, 说道: “终于搞定了！连续折腾三个月, 这次实验数据一口气全跑通了。”老张是我认识五年的朋友, 他在一家第三方医学检验所述职担任技术主管职位。该医院实验室每天要对上千份样本施行处理操作, PCR扩增试剂盒的稳定性以及灵敏度，直接决定他能否按时提交报告。
PCR扩增试剂盒怎么选才靠谱？
以做传染病病原体检测为主的老张他们的实验室, 样本类型繁杂多样, 包括咽拭子, 还有痰液, 甚至组织匀浆都涵盖其中。去年年末, 鉴于业务量急剧增长，其实验室购进了一批新品牌的PCR扩增试剂盒, 老张起初认为性价比还算可以, 毕竟相较于之前所使用的, 价格便宜近乎三成。
结果没用两周, 问题就冒出来了, 有批样本出现了明显非特异性信号的扩增曲线, 有些弱阳性样本直接被漏检了, 那段时间老张天天加班复核数据, 客户催报告的电话一个接一个, 他跟我吐槽说, 试剂盒要是关键时刻出问题, 整个实验室的周期都得往后拖。
扩增效率低是什么原因导致的？
先是老张针对问题进行了全面排查, 涵盖核酸提取环节, 也包括仪器校准方面, 就连操作人员的加样手法都予以了检查, 之后才察觉到原来是PCR扩增试剂盒里的酶体系出现了问题。随后他与厂家技术支撑取得联系, 对方给出的解释是批间差异控制不够严谨, 致使部分批次的扩增效率有所降低。
老张说道, 你去思索一下, 我每日要进行两百多个反应, 只要有一个孔出现问题, 那么, 就极有可能对整个实验产生牵连。他规定实验室每个月都要开展一次试剂盒的批间稳定性验证, 运用已知其浓度的标准品去跑三重复, 从而查看Ct值的变异系数。以往所使用的那款试剂盒, 其CV值始终是被控制在1.5%以内的, 然而, 在更换了新的牌子之后, 有些批次直接飙升到3%以上。
PCR扩增试剂盒灵敏度不够怎么办？
今年三月份的时候, 老张接到了一个紧急的项目, 这个项目是要对一批低病毒载量的样本进行检测。他把库存里剩余的几盒 PCR 扩增试剂盒翻了出来, 结果发现其灵敏度根本无法达到检测限的要求。试剂盒的最低检测限仅仅只能达到每一毫升500拷贝, 然而项目所要求的却是每一毫升200拷贝。
老张当时所采取的做法是, 与之前合作过的三个品牌代理商取得联系, 拿来他们的试剂盒进行平行比对。他运用了同一个标准品进行梯度稀释, 从每毫升一千万拷贝开始一直稀释到每毫升五十拷贝, 针对每个浓度都重复八次操作。三天之后结果得以呈现, 仅有其中一个品牌的试剂盒在每毫升一百拷贝的浓度状况下依旧能够稳定实现检出, 其扩增曲线起峰表现正常, 不存在非特异条带。
当时, 我跟老板讲, 不能仅看价格, 实验室的信誉相较于省钱可要重要得多。老张随后把那批低灵敏度试剂盒全都退回去了, 还换上了经过验证的产品。
PCR扩增试剂盒对不同样本类型的适用性如何？
老张实验室所承接的样本类型繁杂异常, 存在着从口腔黏膜刮取下来的样本, 有痰液样本, 另外还存在从外院送来的经石蜡包埋组织所提取的核酸样本。不同样本当中残留的抑制剂种类以及浓度存在诸多不同, 有一些试剂盒对于复杂样本的耐受性极为糟糕, 一旦进行操作就会呈现出问题。
有这么回事, 他曾跟我说起一个事儿, 是关于案例的, 有一批痰液样本, 使用了一款号称具备“通用型”的 PCR 扩增试剂盒, 结果, 一半数量还要多的样本, 其中的内标都没能扩增出来。后来, 他去查阅文献才弄明白, 痰液当中的粘蛋白以及多糖成分会对聚合酶的活性起到抑制作用, 所以必须要搭配专门的去抑制剂方案才可以。
“自那之后, 我规定实验室每当有一款新的试剂盒进入, 都要先选用五种不一样的样本类型去做验证, 痰液选取十份、血液选取十份、拭子选取十份、组织选取十份、粪便选取十份。”老张讲。此流程尽管耗费时间, 可是能够防止大规模实验失败。
PCR扩增试剂盒的保存和运输需要注意什么？
今年夏天, 老张所在的实验室出了意外，一批从供应商仓库发出的PCR扩增试剂盒原本要通过物流冷链运输, 可冷链断掉了, 在常温状态下放置了两天才抵达, 老张那时没留意, 直接把试剂盒收进了冰柜, 后来使用时发现扩增效率普遍偏低, 怀疑是酶活性部分已丧失。
过后, 他安排实验室特意开展了一项实验, 此实验将同一批号的试剂盒区分成三组, 其中一组在整个过程中保持冷链状态, 一组在常温环境下放置二十四小时, 一组在常温环境下放置四十八小时, 随后运用同样的模板去进行实时荧光定量聚合酶链反应扩增, 最终发觉, 在常温下放置二十四小时的试剂盒, 其Ct值平均延后了一点二个循环, 放置四十八小时的则延后了二点八个循环, 并且其重复性也出现了变差的情况。
以下事情发生之后, 我吩咐采购部门在那份合同当中添加了一项条款, 规定要求供应商给出完整无缺的冷链运输记录, 到达货品之后需要在当场进行温度测量, 要是温度超出适宜范围就要直接拒绝接收。”老张如此讲道。
PCR扩增试剂盒的批间稳定性怎么保证？
在老张的实验室里, 现在存在着一个固定的流程, 那就是: 每当有新批号的PCR扩增试剂盒到货后, 都要单独进行留样以便做性能确认, 他具体会用自行配制的标准品去跑梯度稀释, 从而确认扩增效率处于90%到110%这个范围之间, 而且还要确保和上一批的Ct值差异量不超过0.5。
“批间稳定性的关键指标便是扩增效率的一致性之举以及 Ct 值的重复性之行。”老张归纳讲道。他往昔碰到过一批试剂盒, 针对同一个样本, 上午进行检测运行, 下午再次开展运行, Ct 值相差了 0.8, 历经半天时间的调查核对, 方才知晓是试剂盒批次存在差异所引发的情况。
每个月, 老张都会进行一回内部质控, 将当月各个批次的试剂盒性能数据汇总为表格, 发送给实验室负责人以及采购部门。他对我说: “如此这般去做, 尽管工作量有所增加, 然而相较于出了问题之后再去返工, 显然要划算许多。”。
PCR扩增试剂盒的性价比如何综合评估？
后来, 老张进行了一番算账。先前, 他贪图便宜购买了那一批次的试剂盒, 其单价确实是降低了, 然而, 由于灵敏度不足, 进而导致出现漏检的情况, 并且复检率提高了将近15%, 再加之人工成本以及报告延迟所要面临的罚款, 最终核算下来, 相比使用好的试剂盒, 反而更加昂贵了。
“我此刻评估着PCR扩增试剂盒呢, 并非观测单价, 而是考量单次有效检测成本。”老张如此阐释道。他将试剂盒价格摊入其中, 又把复检率纳入计算范畴, 还把无效数据比例一并考虑进去, 同时计入人工耗材费用, 如此这般, 才核算出一个真切的成本。
今年四月, 老张的实验室重新挑了供应商。他们花一个多月, 从四家候选品牌里筛, 最后选了家技术指标最稳、技术支撑响应最快的。单价比之前贵了一成, 可整体检测效率提高了, 客户投诉率降至零。
前些日子老张邀我用餐, 手持杯子讲道: “从事检测工作, 试剂盒如同战士手中之枪。若枪不准确, 即便枪法高超亦是枉然。当下实验室所使用的这款PCR扩增试剂盒, 运行长达大半年以来从未出现过一回批量性质的问题, 这让我内心安稳许多了。”。
