一个实验员朋友的亲身经历
上个月, 我那位在中科院某研究所工作的朋友老张得以解决困扰他半年的ELISA检测试剂盒选择问题, 他在电话里跟我感慨, 早知道如此这般选择, 他至少能省下三个月时间以及两万块钱。
今年, 老张是三十四岁, 于中科院开展免疫学相关研究已然历经六年时长, 他平日里主要做各类蛋白定量检测, ELISA检测试剂盒差不多是他每日都要去碰触交流使用的工具, 正常情形而言, 做了这般多年的实验, 理应驾轻就熟毫无问题的呀, 可去年年末的时候他却摔了个极为严重的跤。
去年十一月, 他们实验室承接了一个重要合作项目, 该项目要在两个月内做完三百份血清样本的细胞因子检测。老张负责整个检测流程的方案设计以及执行。那时老张想都没多想, 直接采用了之前合作过的一个品牌的ELISA检测试剂盒, 他心里觉得都是做同样的指标, 理应不会出现什么问题。
第一批五十份样本检测完毕之后, 老张瞅着数据愣住了。标准曲线的R平方值仅仅是0.89, 大大低于0.98的可接受标准。更让人觉得头疼的是, 复孔间的变异系数高达百分之十五, 有些样本的OD值居然出现了负值。这表明这批ELISA检测试剂盒的质量根本不符合要求, 所有数据都无法使用。
老张急忙联系了那个品牌的代理商, 对方先是推三阻四, 而后才承认这批试剂盒在生产之中或许存在批次差异, “批次差异”这四个字呐, 从实验人员耳朵听来绝对是噩梦。老张耗费了整整一周的时间重新检测了那五十份样本, 然而时间已经被耽误了不少。
那个周末, 老张请我去喝酒, 他满脸愁容地讲: “你晓得最可怕的情形是啥不? 我先前一直认定只要是在市面上能够买到的ELISA检测试剂盒, 其 Quality 都大致相当。如今来看, 这个想法实在是太过天真。”。
ELISA检测试剂盒的核心参数怎么看
技术参数, 老张开始着手认真研究ELISA检测试剂盒的。他有一番发现, 那就是在好多人面临选择之际, 仅仅眼光聚焦于价格以及品牌之上, 然而却把几个确实至关重要的核心关键点给疏忽遗漏了。
第一位的是灵敏度。老张要检测的细胞因子 ，在血清里 , 浓度极低 , 有的甚至仅几个皮克每毫升而已。要是所选的ELISA检测试剂盒 , 灵敏度欠缺 , 那低浓度样本 , 根本检测不出。他翻看先前那个品牌的说明书 , 发觉最低检测限是十五皮克每毫升 , 而他们所需的精度 , 至少得达到五皮克每毫升。
并非不重要的是特异性。血清样本之中存有数量众多的成千上万种蛋白质, 要是ELISA检测试剂盒的抗体交叉反应率处于较高的状况, 便会将属于其他蛋白的信号错误地判断成为目标蛋白。老张讲道: “这恰似于人群里头寻觅一个人, 最终却把那些长得相像的人全都认错了。”。
存在检测范围, 不同的ELISA检测试剂盒, 其线性检测范围有的只覆盖几个数量级, 有的则高达能覆盖五个数量级以上, 两者差异极为显著。老张所拥有的样本, 浓度跨度极大, 从几皮克一直到几百纳克都存在。倘若检测范围过于狭窄, 那么对于高浓度样本而言, 就必须进行稀释操作, 然而稀释又必定会引入新的误差。
如何验证ELISA检测试剂盒的稳定性
老张在遭遇了踩坑情况之后, 就开始了对ELISA检测试剂盒稳定性问题格外予以重视, 他跟我所言, 稳定性这般事物, 仅仅瞻看说明书可无法瞧出来的, 势必要自身施以做验证的操作。
之后他更换了另一品牌的 ELISA 检测试剂盒, 此次变得机灵了些。拿到试剂盒后, 他未直接处理样本, 而是先行开展三件事情。首件事为进行加标回收实验, 于已知浓度的样本内添加不同数量的标准品, 以此查看回收率能否处于百分之九十至百分之一百一之间。第二件事为开展精密度验证, 接连制作五块板子, 看批内以及批间的变异系数能否控制在百分之十以内。第三件事是进行冻融稳定性测试, 将试剂盒多次冻结融化三次, 看效价有无降低。
这三步验证全都做完毕之后, 老张的心里便有了底气, 这底气源自他所挑选的那个ELISA检测试剂盒, 该试剂盒的加标回收率处于百分之九十五至百分之一百零三这个范围里, 它的批内变异系数仅仅只有百分之四点五, 它的批间变异系数为百分之六点八, 在经过三次冻融之后其效价几乎不存在任何变化, 老张说道: “这样的一个结果让我睡了个安稳觉。”。
不同样本类型对ELISA检测试剂盒的影响
主要以血清作为样本的是老张, 然而在他实验室隔壁工作的同事所做的却是细胞培养上清, 看似仅仅是样本类型存在差异, 可对于 ELISA 检测试剂盒的要求差距却是极大。
有着复杂成分的血清样本, 其中含有大量蛋白质、脂类以及各种代谢物, 极易产生基质效应。基质效应指的是，样本里的非目标成分对抗原抗体反应造成干扰, 致使检测结果出现偏高或者偏低的情况。老张之前那个品牌存在问题, 部分缘由就是基质效应未妥善处理好。
细胞培养的上清相对较为洁净, 然而问题在于, 某些细胞因子于培养环境里极易发生降解。老张的同事曾遭遇过此般状况, 其所使用的ELISA检测试剂盒虽说灵敏度颇高, 可是由于样本保存方式不妥当, 检测出来的结果相较于实际数值低了许多。后来他们察觉到, 必须要在样本当中添加蛋白酶抑制剂, 而且要在两小时之内完成检测。
有组织匀浆样本方面, 这里面含有的干扰物质更为繁多, 老张讲道: “不同的样本种类, 犹如各异的战场。同样一个ELISA检测试剂盒, 于血清当中表现较为良好, 而到了组织匀浆里面有可能全然不行。故而在挑选试剂盒时, 务必要跟厂家确认他们有没有针对你的样本类型开展过验证。”。
批次一致性的重要性
说起来老张那个项目里头最大的教训, 便在于忽略了ELISA检测试剂盒的批次一致性。他头一回所使用的试剂盒, 在从第一批转变到第二批的时候, 标准曲线的斜率居然相差了差不多百分之二十。这究竟意味着什么, 那就是把基于第一批试剂盒所制作出来的标准曲线, 生硬地套用于依赖第二批试剂盒能够获取的数据之上, 最终呈现出来的结果竟然是完全无法对上吻合的。
作为长期项目而言, 批次一致性显得极为关键, 重要到不可或缺, 有些项目持续时长可达半年, 甚至更长是一整年度, 从中间贯穿的过程来看, 可能会存在多次采购ELISA检测试剂盒的必要需求和情况, 要是不同批次之间所呈现出来的差异情形过大, 那么整个项目所涉及的数据, 均无法进行合并在一起的分析操作。
老张后来所挑选的那个ELISA检测试剂盒, 是由厂家给出详尽批次验证报告的。在过去十二个月的时间里, 存在五个批次, 其标准曲线的斜率、截距以及R平方值全都特别相近, 变异系数无不在百分之三以内。老张声称: “有这份验证报告摆在这里, 我方至少可以安心依照同一个标准曲线去核算后续的样本。”。
他专门和厂方的技术支持进行了一次交流, 对方告知他, 批次一致性的关键之处在于抗体原料的稳定性, 一些厂家为了削减成本, 会经常更替抗体原料的供应商, 如此一来生产出来的 ELISA 检测试剂盒很难确保批次一致性, 而那些自行生产抗体的厂家, 批次一致性一般要好许多。
如何通过售后技术支撑降低试错成本
老张当下每次挑选ELISA检测试剂盒时, 都会先同厂家的技术支撑交流半个小时, 这么说道: 他声称一个优秀的技术支撑, 能够为你省去起码一半的试错成本。
技术支撑究竟能给予怎样的协助呢? 首先存在样本测试这一环节, 老张当下会向厂家索要试用装, 先行制作十几份具备代表性的样本, 查看数据是否契合预期, 部分厂家甚至甘愿为客户免费开展预实验, 并出具完整的检测报告。
接着是问题排查, 老张拥有一个微信群, 群里全是各个 ELISA 检测试剂盒厂家的技术支撑人员。当遇到疑问时, 于群内发送一则消息, 有时候仅仅半小时便能寻得解决办法。就像先前有一回他的板子背景值极为高, 技术支撑人员瞥一眼他所拍摄的照片, 立刻发觉问题源自洗板机, 洗涤液残留过于多。
再者是存在数据解读, ELISA检测试剂盒的数据处置有时颇为繁杂, 尤其是在开展竞争法ELISA之际, 标准曲线并非呈线性, 需运用四参数逻辑回归模型予以拟合, 优质的技术支撑会助力客户确认拟合参数是否恰当, 防止因数据处理失误致使误判。
老张讲, 购买ELISA检测试剂盒, 并非单纯是对产品的购置, 更是对于服务的选购, 那些偏偏只售卖产品却全然不管及售后的厂家, 哪怕价格极为便宜也千万不要去选择。
老张现在是怎么选ELISA检测试剂盒的
在历经那次失败所带来的教训之后, 老张着实总结出了一套用于选择ELISA检测试剂盒的办法。他讲这套办法现今于他们的实验室已然演变成了标准的流程。
先要明确要检测哪些指标, 再得清楚对应样本类型是怎样的, 接着要晓得预计的浓度范围究竟是多少, 还需知道所需的灵敏度为多少, 第一步应是确定需求, 这些信息越详尽越好。
分两步走, 第二步是要筛选候选产品, 老张会在数位主要的科研采购平台那里进行搜查行为, 把那排名处于靠前位置、评价状况良好的产品逐项罗列出来, 接着他会着手去查阅这些产品所配有的说明书要点关注灵敏度、检测涵盖范围、特异性、样本验证情形等这类参数。
做预实验是第三步, 老张会向厂家申请试用装，要是厂家不提供试用装, 他会直接排除, 预实验需做加标回收、精密度验证还有基质效应评估, 至少得用三十份真实样本。
第四步, 要施行对于厂家资质开展考察的行动。老张会去查看厂家所具备的生产资质之情形, 查验认证证书的相关状况, 审视技术团队的背景情况。他尤为看重的是, 厂家是否拥有源自自身的抗体研发以及生产能力, 这是由于, 这意味着质量控制方面能够具备更有保障之类的状况。
第五步是对售后支持予以确认, 老张会同厂家技术支撑团队构建联系, 确认厂商于遭遇问题之时的响应时长以及解决问题所采取的方式。
老张讲道, 这套流程看上去繁杂, 然而做过一回之后, 后续便会轻松些。去年十二月时, 他再度购置了一批ELISA检测试剂盒, 严格依据这套流程操作下来, 截至目前已做了将近两百份样本, 数据相当出色, R平方值均在0.995以上, 变异系数从未超出百分之八。
今年三月份之际, 老张所负责项目的全部检测数据均已得出。合作方的负责人查看数据之后极为满意, 当场表明后续的合作能够持续。老张跟我方说道: “你是否知晓, 进行实验便是如此这般, 跨出一步犯错之后每一步都会出错。ELISA检测试剂盒尽管仅仅是一个小型工具, 然而它要是出现问题, 整条数据链都会崩塌。如今回想起来, 当初那次失败反倒成为一件有益之事, 起码让我学会了怎样正确地挑选试剂盒。”。
现在老张在实验室里摇身一变成为了ELISA检测试剂盒方面的“专家”, 他构建了一个共享文档, 将自己使用过的每一个试剂盒的品牌、批次以及测试数据都予以记录, 以此供其他同事进行参考, 上个月, 隔壁实验室的一名博士生前来向他请教, 声称自己所使用的试剂盒数据始终处于不稳定状态, 老张协助他展开了一番排查, 最后发觉问题源自样本的冻融次数之上, 那个博士生先前为了节约样本曾反复进行了五次冻融操作, 结果致使诸多蛋白都出现了降解现象。
老张讲, 进行ELISA检测时, 试剂盒属于工具, 选对该工具仅是第一步, 后续的操作细节显得同样关键, 然而话又说回来, 要是从一开始工具就没选对, 那此后操作再怎么精细, 也是没有作用的。
这大约便是老张 utilize 半年时长以及两万块钱款所换来的教训, 亦是其甘愿分享给全部从事 ELISA 检测之人的经验。
