我亲眼见证朋友如何从“乱筛”到“稳筛”

上月, 我前往深圳龙华, 去寻觅老朋友大刘, 与之一道用餐。大刘于一家生物公司任职研发主管, 其手下管理着十几号工作人员, 每日皆与细胞以及分子进行接触交流。那日, 他甚是难得地未加班, 然而在用餐之际话语极为稀少, 眉头紧皱的程度仿佛能够夹死苍蝇。

“怎么了？项目不顺？”我问。

他轻轻地叹了一口气, 随后将手中的筷子放置一旁, 接着说道: “高通量筛选已经连续出现三次失败的情况, 如今老板已然下达了最后通牒。要是再无法得出相关数据, 那么整个季度的奖金都将会化为泡影。”。

在我听他讲完之后, 才察觉到他所踏入的那些坑, 实际上好多同行们也是都在踏足的。然而问题的根本源头, 常常是出现在一个最为基础的环节里面——细胞株。

细胞株的状态，真的有那么重要吗？

大刘所在的公司, 所从事的是药物靶点筛选服务工作, 其采用的乃是最为主流的稳转细胞株体系。按照常理来讲, 只要能够将目标蛋白稳定地表达于细胞之中, 那么接下来进行的筛选工作, 便属于机械性的活儿。然而, 恰恰就是这种机械性的活儿, 却最容易出现问题。

大刘向我抱怨, 表示: “有着相同的质粒, 处在相同的转染条件之下, 此次筛选出来的IC50跟上次相比, 差距差不多达到了三倍。我吩咐手下小弟去重复做了三遍, 然而其结果却是一次比一次更偏离正常情况。”。

我向他发问, 说道: “你能肯定, 每一次所使用的, 皆是同一批细胞株吗? 其传代的次数, 是否相同? 冷冻保存以及复苏的条件, 稳定与否？”。

他当时愣了一下, 随后说道, 哪能去管得那么细致入微, 要是细胞数量多那就进行扩充, 要是数量不够那就加以补充, 反正每一回都是从液氮当中拿出来的。

这便是问题核心所在, 细胞株并非一次性使用的消耗品, 其具备生命特征是有生命的, 每一回进行传代都每一次传代、每一次实施冻存, 均会致使基因表达水平产生漂移方面影响带来基因表达水平的漂移, 你原本认为是同一株细胞, 可实际上它或许已然出现变化“变心”了。

为什么筛选数据总是忽高忽低？

那天大刘回去以后, 特意耗费了两周时间, 重新审视了全部失败的实验纪录。他惊愕地察觉到: 所有数据出现异常的实验, 背后都指向同一个变量, 即细胞株的使用历程。

比如说, 存在一批运用处于传代15次状态的细胞所开展的实验, 另外一批则采用了传代25次的那种；从表面情形上去审视, 二者分明都是同一细胞株, 然而蛋白表达量的检测最终结果却相差了近乎20%；再有一回, 鉴于液氮罐出现故障, 临时使用了另一批次被冻存的细胞, 结果得出那一批次在被冻存之前其状态就已然是长满了却没能够及时进行传代。

大刘在微信上跟我说起这句话, 即“我一直认定是操作手法出现异常状况, 然而最终发现实际是细胞株批次里呈现的问题”, 其语气之中明显带有懊恼之情。

实际上, 在相关领域之中存在着这样一种说法, 那便是“细胞株倘若不一致, 那么所获取的数据统统都等于白劳作”。众多从事研发工作的人员耗费大量的时间去对筛选条件予以优化, 致力于构建模型, 并且运行算法, 然而却忽视了处于最基础层面的要点——你手中所掌握的细胞株是否真切可靠呢?

他花了三个月，终于摸到了门道

大刘这人存在那么个优点, 在认栽以后会马上着手想办法, 他并未匆忙急忙地重新开展做实验, 而是率先耗费了三天的时间, 将所有能够查到的有关细胞株管理的资料彻彻底底地翻了个遍。

他后来总结了三件事，我觉得很有参考价值。

其一, 构建细胞株的“身份证”制度 , 每当获取新的细胞株 , 便要记载其来源 、冻存日期 、传代次数 、培养基配方 , 切莫偷懒 , 即便仅仅多传了一代 , 也要记录下来 , 大刘特意弄了个Excel表格 , 要求实验室所有人员都务必填写。

第二, 要严格控制传代的次数。他为自己设定了一条红线, 即对于同一个细胞株而言, 最多使用20代。一旦超过这个数量, 无论细胞生长得多么良好, 都要全部报废, 然后重新从早期冻存的批次里进行复苏。这样听起来似乎有些浪费, 然而相比于整批数据作废, 这点浪费实在算不了什么。

其三, 于每次开展实验之前, 进行“基准测试”。在运作高通量筛选以前, 先选取一个标准化合物来测定一下IC50, 要是结果偏离历史均值超出15%, 那么这批细胞株便直接予以放弃。此一动作仅仅需再多耗费半天的时间, 然而却能够节省后续十天的返工时间。

一个简单动作，让项目起死回生

大刘依照这套办法再度走了一回流程, 他挑选了一个在前期的时候留存完好, 属于早期代次的细胞株，于做完基准测试之后, 方才着手展开正式的筛选工作。

结果怎么样？

上周, 他给我打了个电话, 其语气显著地带出轻松之感着: “这批数据, 漂亮到了极点, 进行了接连三次的重复操作, IC50曲线, 几乎呈现出全然重合的态势。老板看过之后，直接给予了下一阶段的经费批文。”。

我向他询问其有怎样的感想, 他这般说道: 在从前的时候, 一直认为细胞株仅仅是一种工具罢了, 觉得人是否高级取决于技术如何。然而如今才弄清楚, 要是工具靠不住, 即便技术再好那也是徒劳无功的。进行高通量筛选的时候, 最先要将细胞株管理妥善, 唯有如此这般才是最为节省钱财以及精力的方式。

看完他的故事，给做筛选的你三点建议

要是你正在施行与这相类似的实验, 或者正打算开启一个高通量筛选的项目, 我给出建议, 你预做三件事情。

首先, 花费些许时间去整理你手中所拥有的细胞株库存情况。 在这些库存里, 哪些属于较早些时候进行冻存的? 哪些又是已经历经了许多代别的传代操作? 对于这些情况, 是否有着详尽细致的记录? 要是答案是相反情形的话, 那就赶快去补充完善它。

其二, 与团队确定一个细胞株运用标准。传代能够达到的上限是多少? 冻存液采用何种配方? 复苏过后到第几天能够开展实验? 将这些规则书写下来，张贴在实验台的前方。

其三, 始终留存一个“黄金批次”, 在获取到全新的细胞株后, 即刻进行一批扩增, 而后将其冻存于最为可靠的液氮罐之中, 此批细胞仅用于充当后续实验的参照标准, 绝对不会轻易予以动用。

高通量筛选属于一个系统工程, 其变量众多, 周期漫长, 成本高昂。有好多人将精力投入于算法优化、数据分析以及化合物库建设方面, 然而却忽视了最为基础、最易于被忽视掉的环节, 此环节便是细胞株的稳定性与一致性。

大刘用三个月的翻车经历换来的教训，希望你能提前看懂。