这是一篇能帮你省下三个月时间的经验分享

我在生物公司做研发时结识的哥们是老张, 他做了快十年的细胞培养, 在技术方面肯定算得上老手。然而今年年初, 他差点因“细胞株”选错这件事, 把自己手上的项目搞砸。今天我将他的这段经历写出来, 期望正在做细胞实验的你, 能少走些弯路。

为什么说细胞株是实验的“地基”

当时, 老张承接了一个新项目, 该项目要求在三个月内完成一批关键的功能验证实验。他依照老经验, 直接于液氮罐里复苏了一株先前用过的细胞株, 心里想着“这东西我熟悉, 肯定不会有问题”。

跑出来第一轮数据, 其结果跟文献里相比, 差的幅度处于整整一个数量级。他没完没了地查了试剂、查了培养条件、查了操作手法, 结果都毫无问题。最终, 他把带着怀疑的目光投在了那株他使用了多年的细胞株之上。

稍后他才察觉到, 细胞株这类事物, 恰似盖楼时打下的根基那般。你所盖楼房多么精美, 然而地基若是歪斜, 一切均为徒劳。对于从事生物实验的人员来讲, 细胞株便是处于最底层的那个“一号位”。其来源、传代的次数、是否遭受污染, 直接对之后所有实验数据的可信度起到决定作用。

选细胞株前，必须先搞清楚来源

那次老张遭遇踩坑情况, 最为关键核心的问题, 恰恰是出在了“来源”这个方面。他所使用的那株细胞, 是经由从几年之前的隔壁实验室那里“借”过来的, 在这中间它究竟传了多少代, 并且有没有做过相关鉴定, 对于此每件谁都没办法说得清。

那之后, 他在跟我回顾细节时讲, 当下已察觉是细胞株身份出现了混淆状况, 甚而存在交叉感染其他细胞的可能性那一段时间, 他每日都沉浸于培养间, 望着经显微镜观察确认为生长态势良好的细胞, 内心却始终忐忑不安: 这些细胞究竟是不是如自己所认为的那般呢?

所以, 选细胞株时首要之原则, 乃是弄明白它的来源路径。或者从具有公信力的细胞库予以购置, 或者自行再度开展STR鉴定。千万不要为求简便, 而采用那些来源朦胧、传代次数已然无法确切明晰记得的“祖传”细胞。

传代次数和稳定性，决定了你能走多远

当老张着手再次去挑选细胞株之际, 又碰到了一个全新的问题, 那便是究竟是要做出选择低代次的决定, 还是做出选择高代次的决定?

之初, 他觉着, 只要细胞可生长, 代数高些许或者低些许并无所谓。而后, 他选取了一株已然传至三十多代的细胞去开展实验, 发觉细胞状态显著变差, 生长速度亦是忽快忽慢, 关键在于, 一些关键的蛋白表达量, 相较于文献而言低了许多。

他这才领悟到, 细胞株所谓的“代次”, 实际就是它寿命的衡量尺度。传代的次数要是越高, 那么细胞产生基因突变以及发生表型漂移的可能性就越大。你费尽心力所做出的实验, 很有可能仅仅是由于细胞自身“年迈”了, 就致使得出全然相悖的结论。

现今他所养成的习惯为, 对于所有新抵达的细胞株来说, 前五到十代的时候要先大量扩增出一批并将其冻存起来, 而展开实验仅使用十到二十代以内的细胞, 一旦超出这个范围, 无论有多便利, 都要毅然决断地扔掉它们, 并重新进行复苏。

污染检测和细胞鉴定，是必须做的“体检”

这件事上老张曾遭受极大损失, 因而往后变得格外审慎。有一回, 他险些被一株貌似“长势良好”的细胞株给蒙骗了。

那时他才刚获取到一株全新的细胞, 凭借肉眼去观察, 培养液呈现出清澈透明的状态, 在显微镜下查看, 细胞的形态同样是正常的。他心里想着, 大概不会有问题, 于是就径直开展了实验。然而, 进行了三次Western Blot实验后, 条带所处的位置却始终无法对上。最终, 他使用支原体检测试剂盒进行检查, 哎呀, 居然支原体显示为阳性。

他讲, 支原体形成的污染是极为坑骗人的那种, 缘由在于它并非将细胞给养到死亡的地步, 仅仅是悄然无声地去改变细胞的代谢状况以及基因表达情况罢了。你根本就察觉不到细胞已然死亡, 然而实验所获取的结果却就是呈现出不对劲的情形。

于是当下他为自己定下了一条绝无更改余地的规矩: 每一批次新复苏的细胞株, 在投入使用之前都必定要完成三件事情, 分别是支原体检测, 细菌真菌检测, STR鉴定。这三件事情若未全部完成, 决然不会将其用于正式实验。

培养条件和操作规范，决定实验成败

成功解决了细胞株自身的来源以及纯净度方面的问题之后, 老张再次着手去琢磨培养条件。他察觉到, 针对同一株细胞而言，倘若更换了一个培养基品牌, 或者血清批号发生了改变, 那么其生长状态均会出现不一样的情形。

他特意耗费了两周光阴? 将从培养基配制, 到消化时长, 再到接种密度, 直至孵育环境的每一项参数? 都再度予以优化了一回。他跟我讲, 诸多实验新手认为“细胞能生长便可”? 实则恰恰相反 , 细胞株唯有在最为适宜的状况下 , 方可稳定地展现你所需求的那些指标。

他如今每获取一株新细胞，都会第一时间去做一次全面的生长曲线测定, 以此来确定最为适宜的换液以及传代时间点。此项工作尽管十分繁琐, 然而一旦将其做好, 后续几个月的实验便都会顺畅许多。

细胞株的“冻存与复苏”是个技术活

过去, 老张针对冻存这一事情, 表现得相当马虎大意。他认为只要把细胞投放至液氮之中, 这样就可以算作完成了。然而, 在经历过此次的教训之后, 他才开始重视起来。

去年, 他在复苏一批关键细胞株时, 有过一次这样的情况, 发现复苏之后活率仅仅不到百分之五十。之后进行核查 , 原来是冻存液的配方过期了, 再加上降温速度未能把控好, 细胞在冻存过程当中大量被冰晶刺破。

冻存的细胞, 他目前会严格依照“慢冻快融”的准则。用到具有程序降落温度功能的盒子来进行冻存, 确保每一分钟温度下降的速度大概在1摄氏度上下。复苏的时候则采用37度的水浴, 并且快速地摇动, 尽可能在1分钟之内实现解冻。他讲, 细胞株的冻存以及复苏, 直接对每次实验起始阶段的质量产生决定性作用, 这个环节若偷懒省事, 后续将会面临诸多麻烦。

定期验证和备份，是最后一道保险

最后阶段时, 老张积累起一整套细胞株管理经验。他手头每株重要细胞, 都在三个不同液氮罐里分别备份。每三个月, 他随机抽查一管复苏细胞做完整鉴定及功能检测。

照着他所讲的而言, 细胞株无疑是实验者的“弹药库”。平常要是没维护妥善, 等真正去到要面对实践的时刻, 才发觉弹药呈现出全是无法正常使用的状况, 那时才晓得想哭却没有眼泪, 堪称无奈至极。

他于今年三月份再度开启了一个全新的项目, 此次仅仅花费尚未到一个半月的时间, 便将所有的预实验数据全部完成了, 并且其结果呈现出稳定且能够重复的态势。他声称, 这完全是由于在细胞株这个具体的环节之上, 他已经预先把所有应该踩的坑全部都踩过了。

祈愿老张的这段过往经历, 可使你于未来随后开展的实验里, 在“细胞株”这一事项之上, 一回便把众多关联之事妥善做对。毕竟呀, 实验最为忌惮的并非是全然做不出结果来, 而是好不容易做出来结果了却难以令人信赖靠谱。