这篇东西，是给谁看的？

我在生物公司时, 有个同事老张, 他是在分子生物学领域辗转徘徊了将近十年的所谓“熟练之人”。上周末的时候, 我俩约定好了一起去品茶聊天, 期间他提到了最近带着新人开展实验时遭遇的令人烦心之事, 话说着说着便不由自主地长长叹息道: “你说这荧光定量PCR, 其原理谁会不明白? 然而真正动手去做的时候, 要么是扩增曲线出现了飘忽不定的状况, 要么就是CT值无法相互对应得上。实际上课本当中可并没有传授这些纷繁复杂、曲折隐晦的内容。”。

我对他极其理解。在行业当中存在一种说法, 进行荧光定量PCR并非难事, 然而要制作出一张既能发给客户又能用于发表文章的优质图片, 这才真正彰显出真本事。这篇文章, 是写给如同老张这般的你, 或者像老张所带领的新人一样的你, 你手中已然具备一些基础, 可是在荧光定量PCR的实际操作过程里, 总会有一些坑被反复踏进。我将老张近期切实的踩坑经历撰写出来, 其中的操作细节以及调整思路, 皆是他用实实在在的付出换来的, 值得你花费五分钟去看完。

荧光定量PCR的CT值为什么总是不稳定？

这个事情要从当年的那个令人印象深刻的三月开始说起, 那个时候老张所在的公司承接了一个大客户丢下来的委托任务, 这个指定的任务是针对一批特定的植物样本当中的某一个专门用来作为校正的内参基因实行精准量化相关的分析工作, 那个客户催促得特别着急频繁, 老张就把这个任务交付给了刚转正不久的小刘, 小刘依照既定的步骤按部就班开始操作, 先是提取RNA, 接着施行反转录, 然后进行上机跑板, 等荧光定量PCR全部完成后, 把最终的结果拿过来查看, 老张看到之后眉头瞬间就皱了起来。

老张对着小刘, 指示他过来查看这三块板的CT值, 强调是同样的模板, 同样的引物情况下，指出同一浓度孔之间竟然相差了快一个循环, 边说着边指着相关数据。

刘某人也一下子愣住了, 说道: “张大哥, 我可是完全依照你所给的那个SOP开展行动的, 根本就没有遗漏任何步骤。”。

老张未言语, 自行去调配了一板试剂, 随后重新启动仪器作业。待结果呈现出来, 他本人也陷入了沉默——的确存在不稳定状况, 其起因并非是操作出现失误, 而是整个反应体系之中的某一个环节产生了问题。

荧光定量PCR体系配制顺序如何影响实验结果？

那个周末, 老张在脑子里将整个实验流程过了一遍, 荧光定量PCR虽是个成熟工具, 但它对反应体系均一性要求极高, 哪怕只是移液器吸头存在一点点残留, 或者试剂混匀不充分, 都会致使每个孔的扩增效率不一样, 最终体现为CT值的波动。

他猛地记起, 去年于一场技术交流会上, 有一位老前辈曾提及, 荧光定量PCR的体系情况是, 有好多人都忽视了该体系配制的顺序, 应该先是添加水, 接下来添加模板, 最终添加 Mix, 如此做模板与酶接触的时间会是最短的, 然而均匀度反倒会是最佳的, 要是顺序反过来, 先是添加 Mix 然后添加水, 又或者先是添加模板接着补液, 那这样每一个孔里的实际酶浓度以及盐离子浓度都有可能存在着微小的差异。

第二天, 老张修正了配方那一套列序, 又吩咐组里其他三位人员, 凭借同样的样式各自开展一回平行试验。三块板子完成跑完流程, 相关数据统计得出, 众人皆舒缓了一口气, 板内重复孔的CT值标准差降至0.1以内。

引物设计在荧光定量PCR中到底有多关键？

没过多长时间, 老张碰到了另外一个棘手的客户需求, 对方提出要针对一段GC含量高达67%的序列开展荧光定量PCR定量。老张他们使用了常规引物设计软件推荐的好几套参数, 然而扩增效率始终偏低, 一直处于85%以下。在实际应用里, 这样的情况是不合格的, 因为一旦扩增效率低于90%, 那么在相对定量过程中, 2^-ΔΔCt计算公式所产生的误差就会呈指数级放大。

三年前, 老张参加了一个荧光定量PCR培训班, 当时记了笔记, 现在翻了出来。那时, 讲师尤为强调一句话: 针对高GC模板来讲, 引物的Tm值不可以一成不变地卡在58至60度, 能够适度上调到62至64度, 与此同时要尽可能使产物长度控制在80至120bp之间。尤为关键的是, 引物二聚体的形成风险务必要运用引物设计软件的高级模块去评估, 不可以仅仅查看基础参数。

他依据这个思路再度设计了三条引物, 三条引物里有一条的扩增效率最终抵达了95.6%。老张跟我谈及这件事情的时候, 自己都在发笑: “做了这么多年, 依旧会在引物设计方面遭受挫折。荧光定量PCR这个事物, 七成依赖体系, 三成依赖引物, 这话一点都不夸张。”。

荧光定量PCR的溶解曲线异常怎么处理？

五月中旬时, 公司内部开展了一批细胞样本的基因表达谱分析工作。老张亲自去跑了一板, 随后结果中的溶解曲线一呈现出来, 可除去其中主峰之外, 在更低温位置处出现了一个小峰。这表明了那里存在着非特异性扩增或者是引物二聚体的情况。

老张没马上换引物, 他先做了件事, 把退火温度梯度跑了一遍, 他用一台老式的梯度荧光定量PCR仪, 设置了55度到65度共8个梯度, 跑完一看, 结果很明显, 当退火温度提高到62.5度时, 那个杂峰彻底没了, 主峰的峰型变得更对称了。

老张在后来的组会上讲, 有很多从事荧光定量PCR的朋友, 当碰到溶解曲线不理想的情况时, 他们首先想到的就是更换引物, 这无疑是正确的做法。然而, 在更换引物之前, 为何不去花费两个小时进行一个温度梯度的运行呢? 有时候仅仅相差两度而已, 结果却仿若天壤之别的程度。这种操作成本最低但却最容易被人们所摒弃。

荧光定量PCR的数据归一化到底怎么做才规范？

六月上旬, 老张得呈上一份涵盖多批数据的报告。难题出现了: 不同批次上机的样品, 其荧光信号强度自身就存有差异, 直接去把原始CT值拿来做比较, 这根本毫无意义。一定要有内参基因去进行归一化处理才行。

老张这回学机灵了, 他预先挑选了三个候选内参基因, 运用GeNorm算法算出它们在全部样本里的表达稳定性, 最终确立挑了个M值最低的基因当作内参。与此同时, 他在每一板反应板之上都放置设定了同一个标准品作为校正样品, 如此这般不同批次之间的CT值便能够借助根据标准品来展开校正比对。

向来我贪图省事, 径直拿GAPDH或者Actin权当内参, 现今回想起来, 那全都是给自己埋下隐患。老张讲这番话之际, 正在规整他的实验记录本, 荧光定量PCR的数据分析, 归一化这一环节倘若做不妥当, 先前的付出统统付诸东流。你所计算得出的倍数变化, 究竟是确实存在差异还是属于系统误差, 根本没法讲明白。

荧光定量PCR的防污染措施有哪些容易被忽略的？

最近老张还跟我讲了个他过去吃过亏的事儿, 有一回他们实验室荧光定量PCR的结果, 居然大面积地出现了阳性信号, 连那没有模板的对照孔都起峰了, 为此排查了好长一段时间, 最终才发现原来是有人在操作过程中, 从有模板的那个区域走到了试剂配制的区域, 却没换手套。

那之后, 老张制定了严苛的规矩, 荧光定量PCR实验得分区开展操作, 有试剂配制区、模板加样区、扩增区, 这三区要做到物理隔离, 每一个区都配备专用的移液器以及耗材。特别是存在一条许多人没留意的小细节, 加完模板后, 绝对不要在打开反应管盖子的情形下停留超出5秒, 由于一旦空气中的气溶胶进入管内, 你的阴性对照就会出现变故。

写在最后：荧光定量PCR这件事，细节就是效率

老张如今带领团队, 他最常挂在嘴边的有这样一句话: “荧光定量PCR这个事物, 你耗费三天去做的准备工作, 跟花三分钟所做的准备, 等跑完板去查看数据就能知晓了。所有被省掉的步骤, 最终都会以出现失误无法成功的形式返还给你。”。

他将这段时期折腾得出的经验, 整理成了十二页的操作备忘录, 以上密密麻麻写满了各类坑壑以及相应的解决办法。我看完之后便觉得, 从事实验的人最为值钱的, 实际上就是这些凭借时间与失败换取而来的细节。

要是你同样在进行荧光定量PCR, 那就静下心来看看自己每一步的操作, 瞧那是不是存在着能够去优化的地方。毕竟, 那仪器和试剂总体都差不多, 而哪能拉开差距的, 正是这些不显眼的“知道”与“做到”。