我认识一个做检测的朋友
老周是我的朋友, 他在华东的一家生物科技公司任职, 担任研发主管一职, 虽说是主管, 然而实际上他手底下仅有五六个人, 他每日都要与各类样本进行接触, 老周这个人技术十分过硬, 不过他有一个毛病, 那便是认死理, 认为价格昂贵的东西必定是好的。
就在去年的那个秋天, 他们所在的公司承接了一个规模相当大的项目, 这个项目的内容是针对一批准农产品展开转基因成分的筛查工作。当时, 样品的数量一下子出现了变化, 从原本的只有几十个猛然间暴增到了上千个, 而老周所拥有的那台已经使用了三年时间的老旧机器, 最终是彻底的承受不住这样的压力了。
实时荧光定量PCR检测结果不准怎么办
最初的时候, 老周并没有把这件事放在心上, 他认为这不过就是再多进行几轮而已。然而, 当第一批结果呈现出来的时候, 数据出现了极为严重且离谱的漂移现象, 甚至连阴性对照都产生了信号。为此, 他连续三天都在加班, 并且更换了三个不同批次的试剂, 可是最终的结果却依旧没有改变。
“我当时差点把机器砸了。”老周后来跟我喝酒时说。
他一开始怀疑试剂存在问题, 更换成了价格高昂的进口试剂, 每一瓶的价格高达三千多元, 而后结果却反而变得更差了, 原因是进口试剂的 buffer 体系与他所使用的样本类型并不匹配。
在经历了长达大半个月的反复折腾之后, 老周才恍然察觉到问题的根源乃是出在了那台机器自身之上。那一台相当老旧不堪的机器, 其光路出现了极为严重的衰减状况, 而且温度的均一性同样已然变得很差劲了, 在同一块板子之上不同的孔位相互之间的Ct值差异竟然能够达到1.5个循环。
荧光定量PCR仪品牌哪个好
项目催促得相当紧迫, 老周着手开始钻研关于更换机器的事宜。他首先寻觅了几家代理销售进口品牌的商家来进行演示, 其中包括罗氏、赛默飞、伯乐这几家, 每一家都宣称自身的产品是最为出色的。老周聆听了这一番介绍后, 反而头脑变得更加迷糊不清了。
“进口的的确会是好的, 然而价格也是那般的‘好’。”老周面带苦笑地 speaking, 一台有着 96 孔的进口机型报价全都在 40 万以上的状态, 并且耗材被卡得相当严格的, 仅仅只需使用原厂专用管, 一盒包含 96 个的要售卖八百多重。
随后, 他们公司里, 来自另一个部门的同事, 推荐了一台国产的产品, 声称其性价比还算可以。老周起初的时候, 是持有抵触态度的, 认为国产的东西靠不住。
但是项目实在是没办法再拖沓下去了, 于是他鼓起勇气硬着头皮让厂家带着机器前来进行测样。然而结果却让他大为吃惊, 原来是同样的样本, 国产机器所跑出来的数据相较于他那台老旧的进口机器而言还要更加稳定。那批转基因大豆样本的Ct值存在着重复性, 其中8个平行气孔之间的标准差竟然仅仅只有0.12。
实时荧光定量PCR怎么选配置
老周此次变得严肃认真起来, 着手去细致地钻研各个厂家商家的技术参数。他察觉到了一桩饶有意义的事情: 进口的那些机器仪器, 其光路设计基本上属于20年前的古老方案, 所采用的仍旧是卤钨灯或者运用LED搭配滤光片的情况。而国产的那件则运用的是高灵敏度CMOS加上光纤传导这一设计方式, 其动态范围直接跨度到了10个数量级。
照老周的说法, 是这般比喻的, 恰似手机摄像头情况一样, 有着这样一种情形, 就是十年之前的老旧旗舰机型, 兴许还比不上现如今的中端机型呢。
他对温控精度予以了格外特别的留意, 做PCR时最担忧的便是温度出现不准确的状况, 54℃的退火效率和56℃的退火效率之间相差能超过一倍, 国产的那一台运用了半导体制冷片并加上PID算法, 将温度均一性达成到了±0.15℃, 升温速度为6℃/秒，老周专门借助热成像仪进行了测量, 96个孔位之间的温差确实是非常小的。
再有就是耗材开放程度了, 进口的机器基本上都得使用原厂耗, 品一个96孔板要三百多元, 并且还得配套专用的封板膜, 磁珠。国产的机器任何品牌的耗、材都能够使用, 成本一下子降低了七成。
选择PCR仪要看哪些指标
最后确定选择国产那台的是老周, 然而, 依据我获自他的经验, 挑选荧光定量PCR仪这件事, 不能仅仅依据品牌来考量, 在这方面, 需要关注以下几点:
首要的是光路系统, 卤钨灯一生的时长大概仅有2000小时, 而LED可达5万小时, 然而更为关键的是检测器, PMT灵敏程度高但通道数量少, CMOS动态范围广却需要优良算法加以支撑, 最好是让生产厂家给出真实样本的检测数据, 而非去看宣传所提到的指标。
其二谈及的是温控性能, 升温的速度, 温度的均一性, 温度的准确度, 这三项之中绝不可缺少任何一项, 尤其是在进行多重PCR操作之时, 不同引物的Tm值之间差距十分微小, 倘若温度控制欠佳就会直接致使扩增效率出现差异。
居于第三位的是软件功能, 老周声称, 于其而言, 最感到厌烦的情形便是, 数据导出之后, 还得依靠手工加以处理, 优良的软件理应能够自身完成绝对定量操作、相对定量操作、熔解曲线分析工作, 与此同时还能够生成报告, 国产的那一台与之配套的软件, 其功能还算比较完备, 甚而能够施行高分辨率熔解曲线分析。
排在第四的要点是售后服务, 对于进口机器而言, 一旦出现故障, 工程师从上海火速飞来索要的上门费用为三千块, 而零部件的等待时长达到一个月实属稀松平常, 然而国产厂家于杭州设置有服务中心, 报修当天, 次日即可抵达。
实时荧光定量PCR价格多少合适
老周在签合同那日, 还特地与我核算了一笔记在纸上的账目。那台国产的机器, 其报价是十二万多, 相比进口设备便宜差点三十万出点头上下。按照他们公司平均每日跑的数量是四块九十六孔板, 一年下来大概跑八万回反应。使用国产机器加上国产耗材, 每一回反应的成本, 相较于使用进口机器加上原厂耗材, 节省了两块三毛钱。
“光耗材一年就能省18万，机器两年就回本了。”老周说。
相较于其他方面而言, 更为关键的一点在于售后情况。国产这边的厂家给予了长达两年的免费保修服务, 而且还额外包含了第一年全部耗材的试用。进口的相关机器仅保修一年, 到了第二年若要进行延保, 则需收取机器价格百分之十五的费用。
经历整整三个月时间后, 老周于办公室张贴了一款表格, 表格内容涵盖机器故障率、数据重跑率、耗材成本以及维修响应时间, 针对这诸类项目, 每一点均开展了细致入微的对比工作。由此观测出, 国产这一台对应设备的综合运行成本仅仅占据进口设备运行成本的百分之六十, 然而出人意料的是国产设备的数据合格率不但没有降低, 反而比进口设备高出两到三个百分点, 达到了更高的水准。
做PCR实验总是出问题是什么原因
老周讲, 他如今回过头去看, 好多问题事实上并非设备本身的问题, 而是人对于设备的理解存在问题。他归纳出了三个最为常见常出现的坑:
头一个是对样品做处理, 好多人觉着PCR机器无所不能, 就连脏的样本都直接拿去上机。老周讲他们当初碰到过一批土壤样本, 其Ct值始终高居不下，而后才发觉原来是腐殖酸抑制住了聚合酶。换用了一个更为高效的提取试剂盒后, 问题便得以解决了。
第二个方面是引物设计。有的同事乐意采用用通俗引物, 感觉如此做既省钱又省事。然而, 不同物种之间的基因序列存在着显著的差异, 通用引物就往往存在特异性不足的状况。老周目前正在开展多重PCR工作, 对于每个引物, 他都会先借助BLAST进行比对, 以此将非特异性结合所产生的风险降低到最小程度。
第三个内容是关于数据分析, 有关Ct值的判定阈值究竟该设定为多少, 好多人是以随意填写的方式来呈现的, 老周表示正确途径乃是运用扩增曲线的拐点联合基线荧光值开展计算, 他先前在使用进口机器时, 软件自行判定出的阈值常常处于偏高状态, 致使低丰度样本被判定为阴性。
荧光定量方法学验证怎么做
今年年初的时候, 老周所在的那个公司, 提出了要去申请一项农产品检测方面的资质认证。评审的老师来到现场进行查看, 对于国产机器的性能存在着疑虑 , 进而要求去做方法学验证。
老周领着团队开展了为期三天的验证工作, 其中包括精密度验证, 准确度验证, 灵敏度验证以及特异性验证, 他们针对已知浓度的标准品实施了6次重复测定, 所得变异系数仅为1.8%, 远远低于行业标准所规定的5%, 线性范围处于从10拷贝至10的8次方拷贝之间, 相关系数是0.999。
评审老师看过数据之后, 没有再讲别的, 认证得以顺利通过。老周讲做这件事让他特别有成就感, 凭借实际数据证实了好设备并非在于贴牌是什么。
荧光定量PCR实验操作技巧
老周如今在他们公司里摇身一变成为了PCR方面的专家, 时常给新近入职的员工开展培训, 他所分享的那几个具备实操价值的技巧给我留下了极为深刻的印象。
当进行多重PCR操作时, 不同荧光通道之间出现串扰这种情况是较为常见的问题。老周解决该问题所采用的办法是, 在那种相关仪器之上先去运行一个单标样本, 之后软件便会自动生成补偿矩阵, 进而把串扰信号扣除掉。
有个事情是关于ROX校正的，好多人在低通量的机型上边不进行ROX校正, 他们认为没这个必要, 然而老周发觉, 要是不做校正的话, 96孔板边缘位置以及中心孔位的信号之间的差异能够相差20%以上, 他目前的习惯是每一块板都会添加ROX内参。
容易被忽略的还有熔解曲线分析。老周讲, 他于做基因分型之际会格外留意熔解曲线的峰形, 假设有肩峰或者宽峰存在, 大概率来讲即为非特异性扩增, 这种情况下就需要重新去优化引物要么调整退火温度。
荧光定量PCR结果判读方法
最近, 老周正从事着一个极具趣味的项目——通过荧光定量PCR来检测水产品当中的沙门氏菌。传统的培养法获取结果需要4天时间, 而PCR法仅仅4小时便能够完成。
然而, 结果判读属于一项技术工作。老周讲, 好多人见到Ct值小于35便认定为阳性, 大于40便认定为阴性, 处于35到40之间的便称是弱阳性。事实上, 这种简单粗暴的方式是不科学的。因为Ct值受诸多因素的影响, 存在样本量、纯度、抑制剂、扩增效率等等这些因素。
正确的做法是, 每次进行实验时都要去做标准曲线, 利用标准品的Ct值以及log浓度来做线性回归, 然后依据样本的Ct值反向计算浓度。要是目的基因的扩增效率处于90%至110%这个范围之间, 且标准曲线的R平方大于0.99, 如此结果才是可靠的。
老周曾在国产的机器之上进行过尝试, 将同一类样品分别稀释成为10倍、100倍还有1000倍之后去制作标准曲线, 其效率均处于98%左右, R平方稳定地保持在0.998以上。他声称这台机器的数据稳定性着实是不错的, 相较于他之前所使用的那台进口的老机器要强出了一截。
如今, 老周那边的公司, 已陆陆续续购置了三台同一型号的机器, 其中一台用于开展研发工作, 一台用来进行检测工作, 另外一台则是用作备份用途。他讲等到今年预算下达之后, 计划把剩余的那几台旧机器全部替换掉。
在前两天的时候, 老周再次给我打电话了, 告知我他承接了一个海关方面的检测项目, 该项目是进行进口冻品的物种真实性方面的测定, 运用荧光定量PCR这种方式来做动物源成分的鉴定, 一台检测机器在一天之内能够检测200余份样本。他表示眼下终于弄清楚了, 做实验并非设备越昂贵就越好, 关键在于适合自身的应用场景, 数据要稳定, 成本要可控, 售后要及时, 这些才是实实在在的道理。
