谈到“实时荧光定量PCR”, 你或许会认为那是实验室中难以避开的棘手难题。最近, 我身旁有个朋友老赵, 凭借这一技术, 硬是将一个快要衰败的项目给挽救回来了。

在一家生物检测公司担任研发主管的老赵, 已经工作快八年了。去年年末, 他们承接了一个大单子, 是要为一家农业公司开展几百份转基因作物样品的筛查工作。原本以为仅仅是加班加快进度的事情, 然而, 第一批数据出来后, 却让所有人都惊呆了。

老赵在那天晚上十点多的时候给我拨打电话, 其声音已然是沙哑的状态了。他讲道, 依照他们以往所采用的方式去开展实时荧光定量PCR操作, 那标准曲线就是没办法做直。而且重复性方面差得简直离谱。三四个同事依次上阵, 更换了试剂, 还调整了程序, 忙活了整整一周时间, 结果依旧是杂乱无章的状况。客户那边催促得十分急切, 项目眼看着就要失败了。

实时荧光定量PCR如何提高准确率

听着电话那头老赵叹气, 我忍不住发问: “你们所用的那个PCR仪, 其配套的软件版本是否太过陈旧了? ”他愣了一下, 称或许真没留意过此细节。随后他回去查询, 果真, 他们一直使用的那台旧机器, 软件竟是五年前的版本, 更新日志记载着“优化了荧光信号采集算法”。

在完成软件更新之后, 老赵又于连夜之际对退火温度以及引物浓度进行了调整。到了第二天早上, 他给我发送了一条消息, 内容为 “行了, 曲线漂亮多了。” 他还特意拍摄了一张屏幕的照片发送给我查阅, 映入眼帘的那条 S 型曲线既陡峭又平滑, 并且 Ct 值均处于正常范围之内。他表述称, 此次终于是弄明白了一个道理, 那便是实时荧光定量 PCR 的准确率, 一半是取决于试剂, 另一半则是取决于你对于仪器的理解。

实时荧光定量PCR实验重复性差怎么办

你觉得这样就结束了么? 并非如此。老赵所负责的那个项目呢, 尽管数据呈现出较为可观的态势, 然而重复性方面还是或多或少存在些不稳定的状况。这个问题在实验室当中实际上是极为常见的, 特别是在进行大批量样品操作的时候, 同一批次的样品三次进行上机检测, 其Ct值竟然能够相差出一个多循环, 像这样的数据要是放到报告里面, 那简直就没法看了。

赵国的这位老者, 此次并未急切地着手行动, 他耗费了两日的时间, 将整个的流程详细地梳理了一番。他随即探寻发掘, 根本性的问题竟然出现在加样的环节之上。他们所在的这间实验室之中, 有数位人员加样的手法并不相同, 其中有些人热衷于贴壁进行加样, 有些人则惯于悬空进行加样, 甚至还有人每回加完之后都会甩动一下枪头。这些细微的动作倘若置于普通的PCR体系之中, 或许并无大碍, 然而对于类似实时荧光定量PCR这般精准测定数据的实验来讲, 所产生的影响可就极大了。

后来老赵统一了标准操作流程, 所有人使用的是同一款移液器, 加样之前要先进行一次预湿, 每块板子加完样之后还需要再离心一回。调整完毕后, 他们拿三份阴性样品再次进行了测量, 三次跑下来的Ct值标准差小于0.2。老赵在周会上讲了一句话, 我认为该话非常有道理: “实时荧光定量PCR实验重复性差, 很多情况下并非机器的问题, 而是人没有管理好自身。”。

实时荧光定量PCR数据分析应该注意什么

已跑出数据, 然而真正的考验尚在后续。老赵跑完那几百份样品之后, 仅是原始数据文件便堆砌了近小半个硬盘。令他最为头疼的是, 众多人拿到数据后径直仅查看个Ct值, 认定小于35即是阳性, 大于35便是阴性, 随后便了事。

他跟我讲, 这样一种粗暴的判断形式, 于实时荧光定量PCR数据分析当中是绝对要不得的忌讳。有一回他们单位同事小吴对数据进行查看, 发觉一份样品的扩增曲线在35个循环之后陡然翘起来了, 便认定那肯定为阳性。随后老赵拿过去瞧了瞧, 那条曲线尽管向上有所延伸, 然而斜率明显存在问题, 并且像熔解曲线压根没有做。他指使小吴去核查一下那个样品的来源, 最终查明是实验进程里出现了气溶胶污染, 根本并非真实的扩增。

起初是老赵定下了一条规矩, 那就是所有呈现阳性结果的情况, 都务必得查看扩增曲线的形状, 而绝对不能够仅仅只去看Ct值。之后, 他又在实验室的那个共享文件夹当中放置了一份详尽的实时荧光定量PCR数据分析手册, 手册里面着重写了究竟该如何去判断非特异性扩增, 以及怎样去处理基线设置不合理的数据现象。并且, 他还特意着重强调了一点, 就是熔解曲线那可是一定要去查看的, 因为好多假阳性的结果恰恰就是依靠这一步骤给筛选掉的。

实时荧光定量PCR实验耗材怎么选择

有一件小事情, 老赵以往从来都没把它当回事, 那便是耗材的挑选, 他们实验室以前一直使用最便宜的那种八连管, 认为反正只是装个反应液, 没必要花那冤枉钱, 然而在这次项目当中, 他们发觉同一批次样品, 靠近管盖边缘的几个孔常常出现异常的荧光信号。

老赵做了好几种管子的尝试, 随后发觉价格高些的那种具备超透光特性的八连管, 其管壁的均匀程度要优越许多, 荧光信号的均一状况直接提升到了一个新层次。他进行了一番成本核算: 就算一盒质量好的管子会多支出几十块钱, 然而节省下来的重复验证时长, 如果换算成人工资金成本, 那节省的数量难以确切知晓。

后来, 他在实验室内部培训当中, 专门讲了一课, 其标题是“实时荧光定量PCR实验耗材怎么选择”。他讲道, 耗材这类物品, 用肉眼是无法看出其中差别的, 不过在机器的视角里, 差别乃是合格的荧光信号与无效数据的分界线。

大约过了两个月, 老赵经手的那个项目圆满并顺利地完成了交付。他递交给客户的报告里, 任意且每项的数据外面都附上了初始的扩增曲线图以及熔解曲线峰图, 客户方专门负责技术方面的负责人在看完之后特意打了一通电话过来, 声称这属于是他们接收到的质量处于高水平的检测报告当中的一份。

老赵在请我吃饭之际讲道, 他以往常常觉得实时荧光定量PCR乃加样、上机以及看结果这三个步骤, 然而当真正将此事物彻底领会之后才发觉, 每一个步骤均存在窍门。从试剂的配方一直到仪器的校准, 从加样的手法直至数据分析习惯, 任何一个细微之处倘若没有做到位, 其结果便是拿报废的板子重新再来, 时间、试剂以及精力全都付诸东流。

当下, 老赵所在的他们那个实验室进行的实时荧光定量PCR实验, 不管批量的规模是大还是小，均能够确保得出数据的质量以及效率。对于新加入的同事, 他也会亲自依次手把手去教, 从软件的设置开始一直到耗材的选择, 将那些容易出错的地方一个个明确地标示出来。他总是这般讲, 从事做实验工作的人, 最为惧怕的并非是实验本身做不成功, 而是根本不清楚究竟是为何做不成功。