上个月, 我有个朋友叫做老张, 他在生物公司里面负责做研发工作, 可他接近被一个项目给逼到疯狂的程度。
老张从事细胞培养工作快十年了, 从293T细胞到HUVEC细胞, 经他手处理过的细胞系多得数不清。然而今年年初的时候, 他承接了一个新项目, 这个项目里需要用到兔原代细胞。他原本觉得这是自己擅长的本事, 就算闭着眼睛也能够完成, 可没想到现实却重重地打了他一耳光。
从三月份起始, 他持续订了三批源自不同供应商的兔原代细胞。头一回, 细胞复苏后进行贴壁, 其比率尚未达到30%, 仅仅过了三天便全都飘浮起来。第二次, 好不容易细胞得以生长增殖, 然而在传代一次之后就出现老化现象,其形态仿若破抹布一般。第三次更为荒诞不经, 货物到手之后进行检测, 标志物表达量全然不对。历经三个月, 实验数据杂乱无章, 项目节点延误了将近两个月, 老板的脸色日益难看。
老张跟我喝酒之际, 他一下子闷了半杯啤酒, 眼睛泛红说道, “我压根就不信这个邪乎劲儿, 这兔原代细胞究竟是啥神奇的东西啊? ”。
为什么兔原代细胞这么难养？
没多久之后, 老张的情绪冷静下来了, 接着就启动了对问题的复盘工作。他察觉到自己犯下了一个错误, 这个错误是行业当中许多人都会犯的: 将原代细胞与细胞系当作同样的事物一样去进行培养。
兔原代细胞, 事实上是直接从兔子组织里分离得到的细胞, 它未曾经历任何人为的永生化改造。这东西可谓十分娇贵, 在离开了体内那般复杂的微环境之后, 相较于外界刺激, 其比林黛玉还要敏感。你所使用的培养基、血清、消化酶、培养皿材质, 甚至于培养箱里那相差零点几度的温差以及二氧化碳浓度的波动, 均有可能致使它“抑郁”或者“暴毙”。
老张先前运用自己调配的完全培养基跟通用型胎牛血清去进行培养, 此方法对细胞系有效果, 然而在兔原代细胞这里却直接失效了。原代细胞需要更为精确的营养配比, 有时还需要特定的生长因子以及细胞外基质去模拟体内的环境。
兔原代细胞的纯度和活力怎么保证？
那个处于四月份的下午, 老张于实验室的角落里翻找出了, 他硕士导师当年所写书籍形式的一本实验笔记。那本笔记有着泛黄的纸页, 纸页里面夹着一张相当旧的试剂单。他由此开始萌生出一种意识, 问题的关键或许并不在他自身的操作方面, 而是在于最起初种下的“种子”实际上是不正确的。
他先前为图省事, 于一家主营抗体与试剂盒, 原代细胞仅为其代理小品类的综合性生物试剂公司购货, 拿到手的细胞, 老张始终认为纯度存疑, 他用流式细胞仪一检测, 不得了, 混杂着显著数量的成纤维细胞, 这般不纯的细胞所做出的实验, 数据准确才怪呢。
之后, 他特意去查找专门从事原代细胞业务的公司, 结果发觉其中状况复杂。有一些公司采用的是极为陈旧的组织块贴壁法来进行分离, 致使杂质众多；还有一些公司即便运用了酶消化法, 然而为了节省成本, 所使用的消化酶质量欠佳, 给细胞带来了不可逆转的损坏。一直到六月, 他经由一位在陆家嘴从事投资工作的朋友予以介绍, 进而接触到一家名为“赛百慷”的公司, 这才算是寻找到了合适的途径。他此次尤为慎重, 特意索要了对方的质检报告, 发觉对方在兔原代细胞的纯度检测方面, 存在一套颇为严谨的内部标准, 并且察觉对方在兔原代细胞的活力检测方面, 同样存在一套颇为严谨的内部标准, 同时还发现对方在每一批出货之前, 都会进行流式检测以及台盼蓝拒染测试。
兔原代细胞的传代次数有限制吗？
有一天新货抵达, 老张自始至终全程亲自去操作。先是进行消化, 接着开展离心, 随后做计数, 每一个步骤都严谨严格依照那对方所提供的Protocol来执行, 丝毫不敢有哪怕是极其细微的一点马虎。
此一回, 细胞进行贴壁的速度显现出快得超乎寻常的态势。在尚不足24小时的情况下, 经显微镜观察过去, 细胞的形态呈现出极为典型的状况, 且铺展得甚为均匀。这般情形之下, 老张内心之中关于此的那块石头终于是得以落地了。
不过, 实验进行到第二星期, 一个全新的问题又冒出来了。该项目需要较多的细胞量, 他原本打算多传几代细胞, 等积攒够所需细胞数量后再开启正式的实验。然而, 他却发觉, 这批兔原代细胞传到第三代之际, 其增殖速度就开始显著降低, 到进入第四代的时, 细胞已然出现了明晰的空泡化与衰老迹象。
他忙不迭翻出赛百慷的技术手册, 手册上明晰写着: 兔原代细胞传代次数一般不超3至5代, 建议于P0或P1代直接用于实验。老张猛拍大腿, 自己先前被养细胞系的习惯误导, 妄图无限扩增, 这哪能实现? 原代细胞天生存在分裂上限, 此乃不可逆转的。他即刻调整自身实验方案, 不再那般执着于传代次数, 而是每次实验前皆预先复苏一批全新细胞, 于最年轻状态时直接上板。
兔原代细胞做干预实验的稳定性如何？
八月份的中旬时段, 老张最终得以开启进行正式的药物干预实验, 这可是他整个项目当中最为关键且最为耗费资金的一步。
他设计了一个给药方案, 这个方案长达72小时, 属于梯度给药方案, 实施此方案需要连续检测细胞活性, 检测细胞活性要针对不同时间点, 还有代谢变化也要检测。以前进行这种长周期实验, 他所使用的细胞不靠谱, 经常实验做到一半, 细胞就崩了, 一旦细胞崩了, 前面几天的数据就全废了, 不仅要向公司赔钱去买试剂, 还得熬夜去补做实验。
然而, 此次情形有所不同, 在使用赛百慷的兔原代细胞之后, 他开展了三次重复性实验, 在细胞处于72小时的药物处理周期期间, 其活率一直保持在90%以上, 三次实验所获取的数据曲线几乎呈现出完美的重合状态, 那个能够通过肉眼观测到的变异系数降低到了他从事该行业以来所见到的最低数值。
上个月底, 他的项目最终顺利交付了。老板在组会上点名予以表扬, 称老张这个季度干得出色, 将最难的任务完成了。老张坐在工位上, 没讲太多话语, 只是静静打开了电脑上的实验记录本, 在“兔原代细胞”那一行之后, 备注了一句话: “种子有误, 努力徒劳。找准源头, 事半功倍。”。
现在, 他办公室的抽屉里面, 经常备着赛百慷的产品目录。按照他个人所说的, 这一回踩的坑是值得的, 尽管投入的学费相对较高, 不过终究还是把其中的门道给弄明白了。要是你当下也正在遭受兔原代细胞的不断折腾, 不妨先从源头着手进行排查。许多时候, 并非是你自身的技术存在问题, 而是你手中的‘种子’本身本就不够纯净、不够有活性。
