就在上个月, 我那位老友老张, 他在生物公司从事研发工作, 于一次实验当中, 险些陷入崩溃的境地。

老张于一家稍有知名度的第三方检测机构工作了将近六年, 其工作主要围绕基因检测展开, 手中监管着三个新人。按常理而言, 对于PCR扩增实验试剂盒这一物品, 他即便闭着眼睛也能够进行操作, 然而, 恰恰就是在这最为熟悉的环节之中, 致使他遭遇了一次严重的挫折。

在去年接近年末的时候, 公司承接了一个规模较大的订单, 有一家制药企业要求他们针对一批临床样本来开展高通量筛查。老张所在的小组在夜间就连夜进行排班部署, 所使用的试剂盒是采用之前始终保持合作关系的老品牌。前头两轮运行完成之后, 得到的数据算是还可以, 然而到了第三轮的时候, 状况出现了, 扩增曲线出现了极为离谱的漂移摆动, Ct值呈现出忽高忽低的不稳定态势, 有好几个样本的熔解曲线竟然直接出现了并非特异性表现的峰状情况。

那个时候, 老张的头皮瞬间就麻了, 他和我讲, 在那个夜晚, 实验室的灯一直亮到凌晨三点, 他领着三个新人逐个进行排查, 加样枪进行了校准, 耗材进行了更换, 热盖温度也进行了测量, 就连核酸提取环节甚至重新做了两遍, 然而, 换上同一批PCR扩增实验试剂盒再次运行时, 问题依旧存在。

他开启了对模板质量问题的怀疑，然而进行了内参扩增, 内参的Ct值却呈现出正常的状态。就在那一个时刻, 他领会到了, 并非样本不干净, 而是试剂盒自身出现了问题。

稳定性差到底坑在哪儿？

老张随后对那批试剂盒的出厂批号进行了一番查询, 之后还与供应商取得了联系, 对方表现得吞吞吐吐, 最终认下这一批次的酶活性的确存在波动情况, 称或许是在运输活动期间冷链出现了问题。

他因这件事遭受了极大损失, 那批样本之中存在一部分属于稀有的存档样本, 重新去进行采集根本是不具备可能性的, 而后是由于扩增遭遇失败, 数据成为无法出具的状况, 药企方面直接扣除了他们公司一半的尾款。

后来老张在复盘的时候跟我讲, 实际上问题早就已经埋下了。之前他们贪图便宜, 始终使用那种小厂生产的通用型PCR扩增实验试剂盒, 认为“只要能用就可以”。然而这种试剂盒最大的隐患便是批次间稳定性差, 此次运气好没有出现问题, 并不意味着下次依旧能够逃避过去的难关。

扩增效率低是不是在拖进度？

更扎心的事情还在后面。

老张需赶时间补样本, 所以从另一家供应商处紧急调了一批新款的高保真PCR扩增实验试剂盒, 这批东西宣称扩增效率高且特异性强，老张觉得即便贵些, 只要不耽误工期便行。

可是, 当跑完一轮之后, 他愣住了。同样是30个循环, 使用老的试剂盒运转出来的产物浓度, 大概处于200 ng/μL左右的水平之上, 然而, 更换成这个新的试剂盒后, 竟然仅仅只有不到150 ng/μL。扩展效率一下子直接下降了一大截, 并且, 连带着让后续的电泳条带也变淡了差不多一倍。

前几日老张忧心忡忡急得火气上涌导致嘴上生出那成圈的燎泡, 新手在此伴随辅助他由始至终重新进行优化退火温度的操作, 温度范围自55℃起始一直试验至65℃, 梯度PCR实验有着整整八条带的结果呈现, 而后却发觉此试剂盒倘若面对GC含量高的模板便难以实现扩增。

而后, 他才经由一位同行之口探听到, 这般PCR扩增实验试剂盒的配方乃是针对低GC含量的模板予以优化的, 进行常规扩增时效果尚可, 然而一旦遇上复杂模板便会暴露本来面目。

背景信号高怎么排查？

当时, 老张遭受折磨的状态达到了相当严重的程度, 最终把他救下的, 是他的一位在中科院进行博士阶段学习的师弟。

师弟听闻他陈述完相关情况以后, 直接甩扔过来一句话: “你去尝试一下那家所生产的, 具备即用型特点的热启动PCR扩增实验试剂盒, 我在这边已经进行了长达半年的实验操作, 其效果非常稳定可靠。”。

老张处于那种将信将疑的状态, 不过最终还是下单订了一盒, 等货物运到之后, 他依照师弟所讲的, 先行去做了一回空白对照, 其成果出乎了大家所预先料想, 就在于那空白孔的荧光数值被压制得格外低, 背景纯净得好似一张毫无瑕疵的白纸处于那种状态, 接着进行了一次上机操作, 针对之前那几个堪称“老大难”典范一般棘手有阻碍的样本, 其呈现出来的扩增曲线平和顺畅得宛如教科书之中所列举的标准示范图例那样, Ct值稳稳地固定在26至27这个区间范围之内, 熔解曲线仅仅呈现出一个单一的峰状, 显得简洁明了, 干脆利落。

当时, 老张长出了一口气，然后跟我说道, “我算是弄清楚状况了, 像试剂盒这类物品, 不能仅仅凭借价格来评判, 也不能单单依据牌子去考量, 而是得关注它与你的实验体系是否适配。”。

往后, 他特意耗费三天光阴, 针对市面上涌现的几款主流的PCR扩增实验试剂盒展开了横向对照。从酶活性开始, 接着是热启动技术, 再到防污染体系, 直至缓冲液的离子浓度调节能力, 一项连着一项去进行测量。最终他察觉到, 真正值得信赖的试剂盒, 存在三个硬性指标是逃不掉的啦: 其一, 批次间稳定性必须要好, 将批间差控制在Ct值0.5以内才算是合格；其二, 扩增效率得要高, 斜率在-3.2到-3.6之间才称作达标；其三, 背景信号要低, 空白孔的基线值不可以超过仪器检测限的5%。

老张如今, 正带着队伍着手搞项目, 再也没有了过去那种随意更换试剂盒的胆量。他制定出这样一条规矩: 针对于来自新开的供应商的 PCR 扩增实验试剂盒呀 , 必须要先去运行三个批次 、五个模板 , 这五个模板里呢 , 既有高 GC 的 , 又有低 GC 的各种情况 , 只有当所有这些情况全部验证合格通过之后才能够准许入库。

上周, 他给我发了微信, 说公司年终奖多发放了两个月, 这是因为他所带领的那组今年实现了零事故, 进而药企那边主动续签了合同。

在我看完了消息之后, 我替他感到很高兴, 与此同时, 我也替自己提了一个醒, 那就是: 从事这一行业, 选择正确的工具远比盲目地努力要重要得多。