就在上个月, 老张从实验室那儿给我发过来一条语音, 其声音之中带着一种憋闷了许久的释然之感, 说道: “终于跑通了。”我询问他跑通的究竟是什么, 他讲, 是原代细胞的那个实验。顷刻间我便明白了, 对于这件事情, 他已然折腾了差不多三年时间。
处于基础研究领域的老张, 就职于一家生物公司且负责细胞生物学这个特定方向的实验工作。三年之前他刚从学校毕业进入这家公司时, 处于一种意气风发的状态, 还觉得在博士生阶段所进行过的细胞实验仅仅只是相对容易的基本功。但是呢所接到的第一个任务是去做原代细胞培养以及功能验证, 他原本设想三天就完全能够把这个任务搞定, 然而事实恰恰相反三个星期过去这个实验全程都不能令其顺利通过。
原代细胞为什么这么难养
刚着手做原代细胞那会, 老张最大的感触可是: 它跟肿瘤细胞系居然全然是不同的状况。以往养Hela或者293T时候, 只要稍微给些培养基, 细胞便会迅猛生长。然而换成原代细胞后却成了, 细胞生长不但迟缓, 还时常出现老化、分化现象, 甚至会直接呈现死亡的态势。
而后, 他查阅了大量的文献, 这才晓得, 原代细胞自身呐是直接由活体组织之中被分离出来的, 尚且未曾历经任何永生化的改造, 故而, 它更加贴近体内的真实情形, 然而, 它也更为脆弱。它根本不像肿瘤细胞系那般具备无限增殖的本事, 当传代的次数一旦增多, 细胞便开始步入衰老的阶段。
老张有所言, 这实际上竟是操持原代细胞最为突出的门槛所在: 你并非于培育一个能够随意予以摆弄的细胞, 你乃是在模拟一个体积精小的生命器官。你务必要尊重它的节律。
原代细胞分离的细节最容易被忽略
老张所踩的第一个大坑, 即为原代细胞的分离过程了, 他是依照一个老文献当中所书写出的步骤, 采用酶消化的方法去处理小鼠的肝脏组织的, 然而结果却是消化时间并未能够控制得当, 多消化了三分钟, 致使细胞直接就如同被“煮”了那般, 混成了一团。
之后, 他跟随一位前辈再次学习了一回流程。这位前辈向他讲, 在进行原代细胞分离之际, 酶消化的时间必须精准到秒, 并且, 针对不同组织、不同动物来源的样本, 酶的浓度以及消化时间都需要再度摸索。前辈还对他进行提醒, 分离出来的细胞应当尽快放置到预冷的培养基里, 不可以等待。
原本有着这般情况: 在那之后, 老张养成了一种习惯, 每次于进行原代细胞分离以前, 会事先于脑子里边将每一步骤逐一走过一遍, 以如同对待拆弹那样的方式来对待时间。
原代细胞的培养基配方不是通用的
分离出细胞, 这仅仅是第一步而已。老张所遭遇的第二个难题在于, 细胞压根就不长。那分离出来的肝实质细胞, 在培养瓶当中待了48小时, 其贴壁率还不到三成呢。
他尝试了几种于市面上常见的基础培养基, 分别是DMEM、RPMI - 1640、F12, 然而均未成功。随后, 他有一位从事神经科学领域工作的同事向其告知, 原代细胞针对于培养基的要求相较于肿瘤细胞系而言要高得多, 它需求更为精准确切的氨基酸组合、更为适宜恰当的葡萄糖浓度, 并且有的时候还需要额外去补充一些生长因子。
老张耗费了满满的整整两个月，尝试了十几种配方组合, 最终才寻觅到适配他那个体系的原代细胞培养基。他讲, 那段日子他每天走进实验室首要之事便是查看细胞状态, 仿若查看自己孩子那般。
原代细胞传代次数要少要准
再有的一件致使老张头疼的事情便是传代, 他在最开始着手操作原代细胞之时刻, 心里想着如同去饲养肿瘤细胞那般, 待其长满以后就去进行传代, 哪怕传个十几代也不会存在问题, 然而在第三次实施传代之际, 细胞却出现了分外显著的形态改变, 变得扁平且体积增大, 并且增殖也陷入了停滞状态。
那时他相当沮丧, 心里寻思莫非是自身把握的技术存在欠缺。随后他察觉到, 原代细胞自身具备有限的传代方面的能力。多数原代细胞于体外正常开展培养时的传代次数, 不会超出五至八代这个范围。许多细胞在P3之后便会逐步开启进入衰老的进程。
老张开初的行径是, 获取细胞之后, 先展开一两代的扩增, 接着迅速施行实验, 绝不拖沓。全部的实验规划均需预先筹备妥当, 不可边操作边思索, 不然等你构思完备, 细胞已然老化了。
原代细胞实验的稳定性要从源头把控
在去年那时的冬天, 老张碰到一例事态, 这一事态致使他几近陷入崩溃边缘。有一项历经两周连续开展的实验, 然而其最终成果呈现出数据波动异常巨大, 且重复性相当糟糕的状况。他最初之时心存疑虑, 怀疑自身操作存在差错, 随后历经全面排查一番, 最终发觉乃是源于原代细胞的批次存在差异。
原来, 他进行的两次实验, 所用到的原代细胞, 是从不同来源的动物身上获取的。尽管, 都是属于同一个品种的小鼠, 可是, 个体差异所引发的细胞状态, 以及表面标志物表达, 都是不一样的。直到这时, 他才真正意识到, 在开展原代细胞实验的时候, 务必要把控好种源的稳定性。
之后, 他向公司申请了具备标准化的动物供应商, 并且作出规定, 每一批用于实验的原代细胞, 都必须源自同一批次、同一性别、以及同龄的动物。同时, 在细胞进行分离之后, 他还会开展一个简单的流式检测, 以此来确认细胞的纯度与状态。
原代细胞冻存也有讲究
老张先前觉着, 细胞冻存乃是把液氮一丢, 等到要用之际取出来复苏便可。然而原代细胞并非如此这般。他头一回冻存了一批原代肝细胞, 时隔一个月进行复苏, 然而细胞活率仅仅只有不到30%。
后来, 他尝试了各异的冻存液配方, 对降温程序予以了调整。他察觉到, 原代细胞对于冻存液里的DMSO浓度极为敏感, 并且降温速率务必十分平缓, 最优选择是程序降温。他还给出建议称, 在冻存原代细胞之际, 最好把密度把控在一个恰当的范围之内, 倘若太密或者太稀, 复苏之后细胞状态均不佳。
原代细胞实验的重复性是可信度的基石
目前在做原代细胞实验的老张, 最看重的便是重复性, 他做的每一组实验, 都起码要重复三次, 并且用的是不同批次的细胞, 虽说这样做既耗费时间又消耗精力, 可他认为这是对数据负责。
在组会上, 他曾一次展示实验结果, 有个同事质疑他, 说: “你这组数据看着挺漂亮, 可只做了一回, 能重复不? ”老张当时没当场反驳, 而是回去后, 又用同一批细胞再去做了一回, 出现数据确有一点偏差。后来他知晓了, 原代细胞的实验受诸多原因影响, 唯一能证实自身结论可靠的办法, 就是不断反复验证, 重复到连自己都毫无怀疑了方才停歇。
原代细胞研究的未来值得期待
处在这家公司里, 负责的原代细胞实验平台, 老张如今使之变得相当成熟了。新人是他所带的, 开始有能力独自去做某些基础的原代细胞分离以及培养了。
他告知我, 关于从事原代细胞这一事情, 让他领悟到两件事情, 其一为切莫低估微环境的复杂程度, 其二是勿要高估自身的经验 , 他讲, 原代细胞宛如一位老派的匠人, 你仅能够顺着它的性子行事, 若想用细胞系的思路去应对它, 必定会遭受损失。
讲完了老张的故事, 他没拿到什么惊天动地的数据, 不过他讲, 做基础研究的人, 在原代细胞这个难搞的事物上能磨出自身的节奏, 那就是最大的收获, 你们要是也在做原代细胞的实验, 建议先做好把这些坑都踩一遍的心理准备。
