上月时段, 老李给我拨来一通电话, 其语气之中携带着难以言明的烦躁情绪。他于一家刚起步尚处于初始阶段的生物科技公司担任研发主管一职, 所负责的乃是分子诊断方向的项目推动进程。电话那头他长叹了一口气然后诉说: “本月又出现了三批实验完全报废的状况, PCR反应试剂盒已经更换了两家不同的供应商, 然而最终的结果依旧是不能达到预期效果。”我与老李相识将近十年时间, 他是一个在做事方面特别认真、对待任何事情都极其较真的人, 此番能够使得他如此头疼烦闷, 这足以表明所面临的问题绝非一般, 而是相当严重的。

老李所在公司主要从事病原微生物检测工作, 对于PCR反应试剂盒的灵敏度以及稳定性有着极高要求。他向我诉苦称, 市面上众多品牌的试剂盒参数虽写得极为繁杂花哨, 然而实际使用起来却完全不是那般情况。部分试剂盒扩增效率的确很高, 只是重复性糟糕至极, 同一批样本先后测试两次, 结果差异极大。另外一些试剂盒保存条件十分苛刻, 稍有疏忽便会失效, 冷链物流稍有延迟, 整批货物就会全部报废。

在去年接近年末那个时候，老李承接了一项紧急的项目, 这个项目是要给某地的疾控中心去开发一套针对呼吸道病原体的快速检测方案。当时时间紧迫任务繁重, 他咬着牙选用了某一款进口品牌的PCR反应试剂盒, 其价格贵到让他心疼不已, 不过他心里想着进口的货物质量应该是值得信赖的。然而, 第一批实验就出现了问题, 那阳性对照发出来的信号微弱得可怜, 可阴性对照却反倒出现了非特异性的扩增情况。

PCR反应试剂盒的灵敏度为什么忽高忽低

在持续的三天时间里, 老李反复查看实验数据, 最终察觉到问题根源在于试剂盒的酶系统。不同品牌的PCR反应试剂盒采所用的DNA聚合酶有很大差异, 有一些是经过基因工程改造的突变酶, 还有一些是直接从嗜热菌里提取的天然酶。进口的那一款品牌上名声很响亮 , 然而其酶活性对样本里的杂质极为敏感, 只要稍微存在一点点抑制物就会停止工作。

他再度尝试了另外一家国产的处于中高端层面的品牌的试剂盒, 此次灵敏度倒是提升上去了, 然而扩增产物的特异性却又不达标准了。跑出来的电泳图呈现出糊作一团的状态, 根本无法分辨清楚目的条带以及引物二聚体。那段时期老李几乎每日加班直至凌晨, 办公室的灯成为了整栋楼最后熄灭的那一盏灯。

如何判断PCR反应试剂盒的稳定性是否达标

今年三月份的时候, 老李参与了一个针对于行业的展会，在展台上发现了那么一家厂商, 这家厂商专门致力于分子诊断原料这块。老李怀着抱着试试看的那种心态去讨要了几套样品回来准备做测试。这一次老李变得学聪明伶俐了些。他没有心急火燎着去大批量采购, 而是首先使用三个批次的试剂盒搞了完整的验证实验用来验证效果。

第一个进行验证的项目是批间重复性, 他将同一个标准品, 使用三个批次的PCR反应试剂盒分别进行扩增, 进而去比较Ct值的变化情况。结果使他眼前一亮, 三个批次的Ct值, 最大偏差没有超过0.3个循环, 这在分子诊断的领域当中, 属于非常高的水平。需要知道的是, 很多试剂盒它的批间偏差能够做到0.5以内就算是优秀了。

之后, 他再次对试剂盒的热稳定性作出测试, 他特意将试剂盒放置于室温环境下长达48小时之久, 以此来模拟实际使用期间有可能遭遇的冷链断裂状况, 通常而言, 试剂盒在这般条件下其性能早就衰减得面目全非了, 然而这款试剂盒的扩增曲线几乎跟保存在-20℃的对照组完全重合。

PCR反应试剂盒的引物设计到底重不重要

在测试进程中, 老李察觉到了一个众多人极易忽视的问题, 有些人认为, 只要PCR反应试剂盒品质优良, 随意设计出一对引物便都能够得出良好的结果, 然而这着实是一个极大的错误认知, 老李向我讲, 再出色的试剂盒也受制于糟糕的引物设计。

他以自身所踩之坑为例, 曾有一次, 他运用一款在业内被公认为稳定的试剂盒, 去跑一个具有高GC含量的目标序列, 在进行引物设计时, 未充分考量二级结构, 结果扩增效率低到令人咋舌, 后来, 他重新对引物予以优化, 将退火温度从58℃调整为62℃, 与此同时, 同样的试剂盒仿若瞬间更换为另一产品, 扩增效率提高了将近三倍。

所以, 当下老李挑选PCR反应试剂盒时, 必定会率先查看厂商是否提供引物设计指导服务。部分具备经验的厂家, 会给出详尽的引物设计参数建议, 甚至能够协助分析目标序列的GC含量、二级结构以及潜在的引物二聚体风险。这些服务虽是看似微不足道, 然而实际运用起来却能节省大量时间。

PCR反应试剂盒的保存方式会影响实验结果吗

今年五月的时候, 老李所在公司新来了一批实习生, 其中有人把一整盒PCR反应试剂盒放置在实验台上, 却忘了将其放回冰箱。等到被发现时, 它已在室温状态下放置了差不多十个小时。当时老李的脸瞬间变绿了, 他觉得这盒试剂完全报废了。然而随后他鼓起勇气使用了一回, 却发现扩增效果几乎并未受到影响。

其后, 他特意打电话去咨询厂家的技术支撑人员了, 这才晓得, 这款试剂盒运用了特别的冻干保护技术, 哪怕是短期内脱离低温环境, 也不会轻易就失活。此特性对于那些经常前往外勤工作的人或者实验室冰箱空间紧张的用户而言, 真的简直就是福音。老李讲, 自那之后, 他便彻彻底底地更换为使用这家厂商的PCR反应试剂盒, 现如今都快半年过去, 再也未曾发生过往批量性实验事故。

PCR反应试剂盒的性价比到底怎么算

好多人挑选PCR反应试剂盒时仅仅盯着单价瞧, 认为价格越低就越具备划算的特质。老李先前亦是这般去思考的, 然而后来经过一番细致的算账之后才发觉自己出现了计算上的差错。他讲曾有一回他采用一款价格低廉的试剂盒去开展实验, 其单价的确是比较低的, 可是扩增效率却不尽如人意, 常常需要将模板量增加一倍方可达成预期的信号强度。不仅试剂成本有所提升, 样本消耗同样也变为了原来的两倍, 如此计算下来反倒要比使用价格稍高一些的试剂盒更加耗费钱财。

进一步来说, 价格低廉的试剂盒极易出现状况, 倘若有一批实验遭遇失败, 那么整个项目就必定得延期。老李所在的公司去年存在一个项目, 因试剂方面出现问题而被耽搁了两个月时间, 仅仅人员工资以及设备折旧这两项, 就亏损了好几万, 这比购买一百盒高端试剂盒所需的费用还要多。

当下他挑选PCR反应试剂盒时, 会全面去算一笔账, 这笔账包含试剂盒单价, 也涵盖扩增效率, 还有批间稳定性, 以及保存便利性, 甚至售后服务支持, 将这些诸多因素通通折算成单次实验的综合成本。依照这样的算法, 他始终在使用的那款属于中高端的试剂盒反倒才是最为划算的。

上周周末, 我同老李一起喝酒, 他举起酒杯讲, 从事分子诊断这个行业, PCR反应试剂盒乃是命根子。要是选对, 项目会顺顺当当；倘若选错, 仅是排查问题的进程就能把人折磨疯掉。他如今最终寻觅到顺手的产品, 实验数据变得稳定, 团队士气同样提起来了, 今年下半年的几个大项目都在顺利推进着。瞅见老李脸上久违的笑容, 我从心底里为他感到高兴。