聚合酶链反应(PCR)技术是在体外进行的由引物介导的酶促DNA扩增反应。PCR的原理是在模板DNA、PCR引物、四种脱氧核糖核苷酸(dNTP)及适当浓度的Mg2+存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的体外酶促合成反应。两个引物分别位于靶序列两端，同两条模板的3’端互补，由此限定扩增片段。PCR反应由一系列的变性→退火→延伸反复循环构成，即在高温下模板双链DNA变性解链，然后在较低温度下同过量引物退火，再在适中温度下由DNA聚合酶催化进行延伸。理论上，经过N次循环可使特定片段扩增到2n-1，考虑到扩增效率达不到100%，所以通常经25到30次循环可扩增到106倍，足够后续实验展开。PCR实验过程中扩增产物常出现各种问题，以下列举解决方案供参考：

一、扩增产物在凝胶中涂布或成片状条带弥散

（1）酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。

（2）dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。

（3）MgCl2浓度过高。可适当降低其用量。

（4）模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。

（5）引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复PCR反应。

（6）循环次数过多；增加模板量减少循环次数至30，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的PCR循环。

（7）退火温度过低。

（8）电泳体系有问题：

①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；

②凝胶没有凝固好；

③琼脂糖质量差。

（9）若为PCR试剂盒则可能：

①由于运输储存不当引起试剂盒失效；

②试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。

（10）降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。

二. 扩增产物出现多条带（杂带）

（1）引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。

（2）循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。

（3）酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。

（4）退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的PCR扩增。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。

（5）样品处理不当。

（6）Mg2+浓度偏高，因适当调整Mg2+使用浓度。

（7）若为PCR试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。

（8）复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。

（9）反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。

（10）引物特异性差。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。

（11）引物量过多。减少反应体系中引物的用量。

（12）模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。

（13）外源DNA污染。确保操作的洁净。