免疫荧光（IF）是一种用于检测以及识别细胞和组织中蛋白质和其他分子的亚细胞分布和迁移的强大检测技术。IF可用作免疫组织化学 (IHC) 或免疫细胞化学 (ICC) 中使用的传统显色标记的替代物。通过使用多种标记物的二级抗体，可以研究感兴趣蛋白的共定位，这是不能通过常规IHC或ICC实现。这是同时分析许多目标蛋白时的一个优势，可同时生成大量亚细胞定位的准确数据。免疫荧光染色是一种常用的细胞和组织学研究技术，它利用特异性抗体与标记荧光染料结合，来检测和定位细胞中的特定蛋白质或其他分子。

以下是免疫荧光染色的原理和步骤：

原理： 免疫荧光染色的原理是利用特异性抗体与目标蛋白质结合，再使用荧光标记的二抗与原抗体结合，从而标记目标蛋白质。荧光信号可以通过荧光显微镜观察，以显示目标蛋白质的位置和分布。免疫荧光染色可以用于检测和定位细胞中的特定蛋白质、抗原、细胞器等，对于研究细胞和组织的结构、功能和病理生理过程具有重要意义。

细胞免疫荧光染色适用于鉴定细胞的免疫荧光检测的实验方法。

步骤：

1、细胞或组织样品的固定：通常使用甲醛或乙醛来固定细胞或组织，以保持其形态和蛋白质结构的完整性。

2、抗体的孵育：将特异性抗体加入到样品中，与目标蛋白质结合。

3、洗涤：用缓冲液洗去未结合的抗体。

4、二抗的孵育：加入荧光标记的二抗，与原抗体结合。

5、洗涤：用缓冲液洗去未结合的二抗。

6、荧光显微镜观察：使用荧光显微镜观察样品，荧光信号可显示目标蛋白质的位置和分布。

实验过程 (48孔板为例)：

1、细胞种植：将细胞消化后按照所需浓度种植于48孔板，置于37°C二氧化碳培养箱培养过夜。

2、固定：取出48孔板，弃去培养基，每孔加入PBS 500μl，静置5min，吸走液体，每孔加入200μl 的4%多聚甲醛固定液，室温固定30min。

3、洗涤：每孔加入PBS 500μl，静置5min，吸走液体，重复3次。

4、通透：每孔加入200μl 的0.1% Triton x-100，室温静置15min。（膜表达的蛋白鉴定建议不通透，具体参考抗体说明书）

5、洗涤：每孔加入PBS 500μl，静置5min，吸走液体，重复3次。

6、封闭：每孔加入500μl 5%牛血清封闭液，37℃孵育2h或者置于冷藏冰箱中过夜，弃去液体。

5.7一抗：每孔加入200μl采用2%牛血清稀释的抗体（稀释比例参考抗体说明书），37°C静置2h或者4℃过夜。

8、洗涤：PBST每孔500μl，静置5min，吸走板中液体，重复3次。

9、封闭：每孔加入200μl 5%牛血清封闭液，室温封闭15min。（本底高的可以加这一步）

10、二抗：每孔加入200μl采用2%牛血清稀释的二抗（种属和一抗的要对应，举例：一抗是来源是兔抗X，二抗就用Y 抗兔-荧光，稀释比例参考抗体说明书），37℃避光孵育1h。

11、洗涤：PBST每孔500μl，静置5min，吸走板中液体，重复3次。

12、染核：Hoechst 浓度2μg/ml，每孔200 μl，室温避光染色15min。

13、洗涤：PBST每孔500μl，静置5min，吸走板中液体，重复3次。

14、拍照：洗涤完毕每孔加入200μl PBS,将细胞置于显微镜下观察，选择所需倍数，拍照保存。