| 货号 | 纯度 | 规格 | 目录价 | 会员价 | 库存 | 数量 | 购买 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| AP62269-50T | 50T | 50T | ¥22450.00 | 登录查看 |
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【预期用途】
本产品就是以染料法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测的试剂盒。
【检验原理】
本试剂盒可在一次反应中快速检测五种病原体：肺炎链球菌 1 型、3 型、4 型、5 型、6 型。肺炎链球菌的血清型分类是基于其荚膜多糖抗原结构的差异，目前已发现的血清型超过 100 种。不同血清型在致病力、流行特点、好发人群和引起的疾病类型上存在显著差异。1 型和 5 型是经典的致病菌，在成人和儿童中均占有重要地位，且与脓胸等并发症相关。3 型因其独特的生物学特性而成为毒力最强的血清型，需要警惕其导致的高病死率。型属于常见致病血清型，广泛存在于各类感染中。6 型（特别是 6B）则是儿童感染的“主力军”，且耐药问题较为突出。根据探针法荧光定量 PCR 原理开发。
【试剂组成】
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名 称 |
规 格 |
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2 × Probe qPCR Mix |
700uL×1管 |
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ddH2O |
1 mL×1 管 |
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五重 qPCR 引物混合液 |
2 00uL×1 管 |
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五重 qPCR 探针混合液 |
110 uL×1 管 |
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五重 qPCR 阳性对照(1×10E8 拷贝/μL) |
50μL |
说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
【运输及保存】
避光-20±5℃保存，有效期12个月。开封后避光-20±5℃保存，对有效期没有影响；
冰袋低温运输4天、反复冻融5次对效期没有影响。
【自备试剂】
样品 DNA。
【适用仪器】
ABI 、安捷伦MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf等系列荧光定量PCR检测仪。
【使用方法】
一、核酸提取(样本制备区)
用自选方法提取纯化样品 DNA，本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。
二、稀释标准曲线样品(样本制备区)
（由于阳性对照浓度高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，避免污染样
品或本试剂盒的其他成分）。
1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL ddH2O，（最好用带芯枪头，下同）。
3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
若无需制作标准曲线，将阳性对照稀释到 1×10E5 拷贝/μL 即可。
准备足量的 qPCR 管（样品管、阴性对照管、阳性对照管），向各 qPCR 管中分别加入下列成分。：
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成分 |
N个 待检样品管 |
qPCR 阴性对照管 |
qPCR 阳性对照管 |
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2 × Probe qPCR Mix |
各 12.5 μL |
12.5 μL |
12.5 μL |
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五重 qPCR 引物混合液 |
各 4 μL |
4 μL |
4 μL |
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五重 qPCR 探针混合液 |
各2μL |
2μL |
2μL |
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ddH2O |
各 4.5 μL |
4.5 μL |
4.5 μL |
转移至模版添加区
四、添加模板(模板添加区)
向 qPCR 管中分别加入 2ul 模板，顺序为阴性对照（ddH2O）、待测样品模板、五重qPCR 阳性对照，离心 30 秒，立即进行扩增反应。
将 qPCR 管放置在 qPCR 扩增仪器样品槽相应位置，进行扩增，扩增程序如下：
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过程 |
温度 |
时间 |
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预变性 |
95℃ |
3 min |
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qPCR 反应 （40 个循环） |
95℃ |
15sec |
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60℃ |
20sec |
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信号通道 |
同时选择 FAM/HEX/ROX/Cy5 通道采集荧光信号 |
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Target |
荧光基团 |
猝灭基团 |
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肺炎链球菌 1 型 |
FAM |
MGB |
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肺炎链球菌 3 型 |
HEX |
None |
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肺炎链球菌 4 型 |
ROX |
MGB |
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肺炎链球菌5 型 |
Cy5 |
MGB |
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肺炎链球菌6 型 |
Cy5.5 |
BHQ2 |
1. 如果制作标准曲线，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，推算出其浓度。
2. 如果未制作标准曲线，按照如下标准判定结果：
阳性对照结果：Ct 值<30，有明显指数增长，呈典型的 S 型曲线。
阴性对照结果：Ct 值>38 或无 Ct 值，无明显指数增长期和平台期。
样本检测结果：Ct 值<35，有明显指数增长，表明样本中检测出该菌种，结果为阳性；Ct 值>38 或无 Ct 值，表明样本中未检测出该菌种，结果为阴性；Ct 值在 35-38 范围，应对样本进行复检，如重复实验结果 Ct 值仍在 35~38 范围，有明显指数增长，则判定为阳性，否则为阴性。
【注意事项】
1. 所有操作严格按照说明书进行；
2. 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
3. 反应液应避光保存；
4. 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5. 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6. 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7. 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
8. 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
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资料/datasheet
