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发布日期:2025/5/30 16:10:00

ELISA(酶联免疫吸附测定)包被细胞样本通常涉及细胞培养上清或细胞裂解液的处理,以检测细胞分泌的蛋白质或胞内蛋白。具体步骤如下:

一、细胞培养上清的处理:

1. 对于贴壁细胞,直接收集上清液或在2-8°C下以2500rpm离心5分钟,收集澄清的上清液。

2. 对于悬浮细胞,先在2-8°C下以2500rpm离心5分钟,收集细胞,然后用PBS轻轻混匀,再次离心,收集澄清的上清液。

3. 收集的上清液可立即用于检测,或分装后在-80°C冻存备用。

二、细胞裂解液的制备:

1. 悬浮细胞:离心收集细胞,加入预冷的PBS清洗,再加入RIPA裂解液(pH 7.3,不含NP-40TritonX-100和高浓度DTT)和蛋白酶抑制剂,冰上裂解30分钟至1小时。

2. 贴壁细胞:吸走上清,用PBS洗三次,加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂,用细胞刮轻轻刮下细胞,裂解条件同悬浮细胞。

3. 裂解后,10000rpm离心10分钟,取上清液立即使用或冻存。

三、ELISA包被: 

1. 使用5μg/ml的包被抗原(如BSA偶联的小分子抗原)与PH9.6的碳酸盐缓冲液或PH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液混合,加入到微孔板中。

2. 室温、4°C37°C下过夜包被,具体温度根据抗原稳定性选择。

四、洗涤与封闭: 

1. 弃去包被液,用PH7.2-7.4PBST洗涤三次,每次3-5分钟。

2. 每孔加入1%BSA10%小牛血清或5%脱脂奶粉等封闭剂,37°C封闭2小时,以减少非特异性结合。

六、一抗与二抗的结合: 

1. 加入适当稀释的一抗,孵育1.5小时。

2. 再次洗涤后,加入稀释的酶标二抗,孵育1小时。 

七、显色与读数:

1. 加入底物溶液(如TMB),室温避光显色10分钟,加入终止液(2M硫酸)终止反应。 

2. 使用酶标仪读取450nmOD值,评估血清抗体水平。

3. 选择合适的包被条件(抗原、浓度、温度)、封闭剂以及孵育时间是确保实验成功的关键。此外,包被后应进行充分洗涤以去除未结合的物质,确保结果的特异性和准确性。

 

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